Via das pentoses fosfato na saúde e na doença: da disfunção metabólica aos biomarcadores

Tese de mestrado, Análises Clínicas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2013The Pentose Phosphate Pathway (PPP) fulfils two unique functions: (i) the formation of ribose-5-phosphate (R5P) for the synthesis of nucleotides, RNA and DNA, supporting cell growth and proliferation; and (ii) the formation of the reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH). NADPH carries chemical energy in the form of reducing power, being essential to the cellular oxidative defense system and is also the universal reducing agent in many anabolic pathways, such as cholesterol and lipid synthesis and fatty acids chain elongation. The PPP comprises two separate branches: (i) an oxidative, non-reversible branch, and (ii) a non-oxidative, reversible branch. The oxidative branch primarily depends on glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD), whereas transaldolase (TALDO) is the rate-limiting enzyme for the non-oxidative branch. Although the oxidative branch of the PPP is recognized as the source of NADPH and R5P, the overall contribution of the non-oxidative branch to metabolism and cell survival is poorly understood. Metabolism of glucose through the PPP influences the development of diverse pathologies. Deficiency of the PPP enzyme G6PD represents the most common genetic defect in humans and leads to NADPH depletion in red blood cells (RBC), predisposing to oxidative stress-induced hemolytic anemia. Recently, two new defects in the PPP were described: ribose-5-phosphate isomerase (RPI) deficiency and transaldolase (TALDO) deficiency. The first defect is associated with progressive leukoencephalopathy and mild peripheral neuropathy. The metabolic profile of the disease is associated with elevated levels of ribitol and arabitol in the brain, as showed by magnetic resonance spectroscopy (MRS), urine, plasma and cerebrospinal fluid (CSF). In contrast, TALDO deficiency is associated with liver symptoms, while other organs are affected to a variable degree. The metabolic phenotype of the disease is characterized by increased urinary concentrations of the polyols: erythritol, arabitol, ribitol, sedoheptitol, perseitol and the sugars: sedoheptulose and mannoheptulose, as well as sedoheptulose-7-phosphate. The profound influence of TALDO on NADPH levels, mitochondrial dysfunction and oxidative stress is ascribed to the blocked recycling of R5P to glucose 6-phosphate (G6P) and to the proposed linkage to aldose reductase (AR) that converts the accumulated C5-sugar phosphates to C5-polyols at the expense of NADPH. Mitochondrial dysfunction associated to TALDO deficiency leads to liver disease progressing from non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) to non-alcoholic steatohepatitis (NASH), cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Therefore, TALDO deficiency can account for liver disease of variable severity. The diagnosis of the PPP deficiencies is possible by biochemical evaluation of polyols’ and sugars’ profiles in body fluids. Abnormal concentrations of these compounds occur in a number of pathological conditions such as diabetes mellitus, renal and liver disease and several inborn errors of carbohydrate metabolism, such as galactosemia. Therefore, it is necessary to take into account the variability of metabolic profiles and to understand their meaning. Along the thesis, it is our goal to revise the metabolic pathway of pentose phosphates and its implication in the associated disease states. Furthermore, the development and validation of the analytical methods (GC-FID and GC-MS) will be presented and discussed. We will also present our preliminary results upcoming from two separated studies, focused on the characterization of the PPP intermediate metabolites profile in (1) pre-selected cases with unexplained hepatosplenomegaly and/or liver dysfunction in a pediatric population; and (2) in adult patients with liver dysfunction (NAFLD or AFLD). We hope to find new biomarkers and metabolic signs which may open new perspectives of research for better understanding liver dysfunction. Interesting data is described, in the pediatric population, where a patient with an isolated sedoheptulokinase (SHPK) deficiency is reported. All the subsequent studies, some still in course, seem to confirm this new defect in the PPP. In the adult population our findings point to the putative importance of polyols as possible biomarkers of liver dysfunction progression.A via das pentoses fosfato tem dois objectivos principais: (i) a formação de ribose-5-fosfato (R5P) para a síntese de nucleótidos, ARN e ADN, essenciais para o crescimento e proliferação celular; e (ii) a redução de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH). A NADPH transporta energia química sob a forma de poder redutor, sendo essencial para o sistema de defesa oxidativo das células e sendo ainda o agente redutor universal de inúmeras reacções anabólicas, tais como a síntese de colesterol e lípidos e o prolongamento das cadeias dos ácidos gordos. A via das pentoses fosfato é constituída por dois ramos: (i) um ramo oxidativo, não reversível, e (ii) um ramo não-oxidativo, completamente reversível. O ramo oxidativo é dependente da actividade da enzima glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), enquanto a transaldolase (TALDO) é a enzima limitante do ramo não-oxidativo. Apesar do reconhecido papel do ramo oxidativo da via das pentoses fosfato como fonte de NADPH e R5P, a contribuição da via não-oxidativa no metabolismo e sobrevivência celular é pouco conhecida. O metabolismo da glucose na via das pentoses fosfato influencia o desenvolvimento de diversas patologias. A deficiência em G6PD é o defeito genético mais comum na população humana, levando a níveis reduzidos de NADPH nos eritrócitos e predispondo ao aparecimento de anemia hemolítica induzida por stress oxidativo. Recentemente, foram descritas duas novas deficiências enzimáticas na via das pentoses fosfato: a deficiência em ribose-5-fosfato isomerase (RPI) e a deficiência em transaldolase (TALDO). A primeira deficiência enzimática está associada a leucoencefalopatia progressiva e ligeira neuropatia periférica. O perfil metabólico da doença revela níveis elevados dos polióis: ribitol e arabitol no cérebro, tal como demonstrado por ressonância magnética, na urina, plasma e líquido cefalorraquidiano (LCR). Por outro lado, a deficiência em transaldolase está associada a alterações hepáticas, havendo um grau variado de comprometimento por parte de outros órgãos. O fenótipo metabólico desta deficiência está associado à excreção de níveis elevados dos polióis: eritritol, arabitol, ribitol, sedoheptitol, perseitol e dos açúcares: sedoheptulose e manoheptulose, bem como de sedoheptulose-7-fosfato. A forte influência da transaldolase nos níveis de NADPH em situações de disfunção mitocondrial e stress oxidativo é atribuída ao bloqueio da reciclagem da glucose-6-fosfato a partir da ribose-5-fosfato e à hipotética ligação à actividade de aldoses redutases (AR), responsáveis pela conversão dos açúcares-C5-fosfatados a C5- polióis, às custas de NADPH. A disfunção mitocondrial associada à deficiência em transaldolase leva a uma doença hepática progressiva que se inicia com o aparecimento do fígado gordo não alcoólico (NAFLD), passando a esteatohepatite não alcoólica (NASH), cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC). Assim, a deficiência em transaldolase está associada a doença hepática de variado grau de severidade. O diagnóstico dos defeitos da via das pentoses fosfato é possível pela análise dos perfis bioquímico dos açúcares e polióis nos fluidos biológicos. Concentrações elevadas destes compostos aparecem em diversas situações patológicas, tais como a diabetes mellitus, a doença renal e hepática e vários erros hereditários do metabolismo dos hidratos de carbono, tais como a galactosemia. Assim, torna-se imperativo ter em conta a grande variabilidade de perfis metabólicos e o conhecimento dos seus significados. Ao longo desta tese, é nosso objectivo fazer uma revisão sistematizada da via das pentoses fosfato e a sua implicação em estados de doença. Será ainda apresentado e discutido o desenvolvimento e validação dos métodos cromatográficos (GC-FID e GC-MS) desenvolvidos. Finalmente, apresentaremos os resultados preliminares de dois estudos, iniciados com o objectivo de caracterizar os metabolitos intermediários da via das pentoses fosfato em (i) uma população pediátrica de casos pré-seleccionados com hepatoesplenomegália de causa desconhecida e/ou com disfunção hepática; e (ii) uma população de adultos com disfunção hepática (fígado gordo não alcoólico ou doença hepática devida ao abuso do consumo de álcool). Esperamos descobrir novos biomarcadores ou alterações metabólicas importantes, que possam abrir a porta a futuros estudos para melhor compreender a disfunção hepática. No estudo efectuado na população pediátrica são apresentados resultados interessantes de um doente em que se descreve pela primeira vez um défice isolado da enzima sedoheptulose cinase (SHPK). Todos os estudos subsequentes, alguns ainda em curso, apoiam a descoberta desta nova deficiência enzimática na via das pentoses fosfato. No estudo da população adulta com disfunção hepática, os nossos resultados apontam para uma possível importância do perfil dos polióis como biomarcadores da progressão da disfunção hepática. Palavras-chave: Via das pentoses fosfato; deficiência em ribose-5-fosfato isomerase; deficiência em transaldolase; fígado gordo não alcoólico; deficiência em sedoheptulose cinase