Development of a small library of macrocyclic diterpenes through molecular derivatization : evaluation of their activity as P-gp inhibitor

Tese de mestrado, Química Farmacêutica e Terapêutica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2013The present dissertation focuses on the relevance of macrocyclic diterpenes as leads for natural product-based anticancer drug development. In particular, the applicability of this type of compounds as P-glycoprotein (P-gp) inhibitors is thoroughly explored, given the well-known role of P-gp overexpression in the emergence of many multidrug resistant cancers, a major public health problem worldwide. Herein, a small library of macrocyclic lathyrane diterpenes was developed through molecular derivatization, using epoxyboetirane A as starting material. This compound had been previously isolated from Euphorbia boetica in large amounts, thus allowing several chemical transformations in the lathyrane scaffold, including hydrolysis, reduction and acylation reactions. Some of these transformations furthermore involved a base-catalyzed epoxide migration commonly referred to as the Payne rearrangement, as well as a Michael addition and an α-ketol rearrangement. Overall, twenty three new epoxyboetirane A derivatives were prepared, in addition to three formerly reported compounds, having all been fully characterized by onedimensional (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) and bidimensional (HMQC, HMBC and NOESY) nuclear magnetic resonance experiments, as well as by mass spectrometry. The antiproliferative and cytotoxic effects of the synthesized compounds were assessed on multidrug resistant mouse lymphoma and human colon adenocarcinoma cells. Some of them were furthermore tested on mouse embryonic fibroblasts so as to investigate their selective cytotoxic potential. Their ability to modulate P-gp was also evaluated on both cancer cell lines, by the rhodamine-123 accumulation assay, aiming to explore the effect of the implemented chemical transformations on P-gp-binding affinity. The collective analysis of the biological results and physicochemical properties of all twenty six molecules successfully enabled the establishment of structure-activity relationships, which was the ultimate goal of this project. To conclude, some of the most active derivatives were tested together with doxorubicin in a combination chemotherapy experimental model. All in all, most of them demonstrated to be extremely promising as multidrug resistance modifiers, attesting their usefulness in future rational anticancer drug development.A presente dissertação pretende explorar a importância dos diterpenos macrocíclicos enquanto protótipos na descoberta de novos agentes anticancerígenos de origem natural. Em particular, a aplicabilidade deste tipo de compostos enquanto inibidores da glicoproteína-P (P-gp) é amplamente analisada, tendo em conta o já conhecido papel da sobreexpressão da P-gp no surgimento de vários tipos de cancro multirresistentes, um problema grave de saúde pública. Neste trabalho, foi criada uma pequena biblioteca de diterpenos macrocíclicos com o esqueleto do latirano por derivatização molecular, utilizando o epoxiboetirano A como material de partida. Este composto havia sido previamente isolado de Euphorbia boetica em quantidades suficientes para permitir uma série de transformações químicas no esqueleto original, incluíndo reacções de hidrólise, redução e acilação. Algumas envolveram ainda uma migração de funções epóxido usualmente citada como o rearranjo de Payne, uma adição de Michael e o rearranjo de uma α-hidroxicetona. No total, foram vinte e três os novos derivados preparados, para além de outros três compostos já descritos na literatura. Todos eles foram totalmente caracterizados através de experiências de ressonância magnética nuclear unidimensional (1H-RMN, 13C-RMN e DEPT) e bidimensional (HMQC, HMBC e NOESY), e por espectrometria de massa. Os efeitos antiproliferativo e citotóxico dos compostos sintetizados foram avaliados em células multirresistentes de linfoma de rato e de adenocarcinoma de cólon humano. Alguns foram ainda testados em fibroblastos de rato de forma a investigar o seu potencial citotóxico selectivo. Para além disso, a actividade moduladora da P-gp destes compostos foi avaliada em ambas as linhas celulares de cancro tendo em vista a exploração do efeito das transformações químicas implementadas na sua afinidade para a P-gp. A análise dos resultados culminou no estabelecimento de relações estruturaactividade, objectivo primordial deste projecto. Por fim, alguns dos derivados mais activos foram testados em conjunto com a doxorrubicina num modelo experimental de quimioterapia combinada. No geral, estes compostos mostraram ser extremamente promissores enquanto moduladores da multirresistência farmacológica, atestando a sua utilidade no desenvolvimento racional de novos agentes anticancerígenos.The project was financed by Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/QUI-QUI/099815/2008, PTDC/QEQ-MED/0985/2012, Pest-OE/SAU/UI4013/2011