Efeito citotóxico da glicidamida em células mamárias não tumorais : avaliação do papel de inibidores da reparação do DNA

Tese de mestrado, Controlo da Qualidade e Toxicologia dos Alimentos, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012A acrilamida (AA) é um conhecido agente tóxico com diversas aplicações industriais, tendo sido encontrado em quantidades significativas numa variedade de alimentos cozinhados. A AA tem sido classificada como provavelmente cancerígena para o homem e tumores de mama benignos e malignos induzidos pelo AA têm sido observados em roedores. Além disso, existem evidências que a glicidamida (GA), um epóxido gerado por biotransformação presumivelmente através do CYP 2E1, será o agente responsável pela genotoxicidade da AA. No entanto, os mecanismos de reparação de lesões de DNA desencadeados pela GA precisam de clarificação adicional. Neste contexto, este trabalho visa avaliar o efeito de inibidores de reparação do DNA face à citotoxicidade induzida pela GA em células epiteliais humanas da mama, MCF10A. A abordagem metodológica utilizada baseou-se na avaliação da viabilidade das células tratadas com GA (ensaio MTT) na presença de inibidores dos processos de Reparação por Excisão de Bases (BER) e da proteína ataxia telangiectasia mutada (ATM), um componente crítico na sinalização e regulação da reparação de quebras de cadeia dupla. Para a BER, foi usado um inibidor indirecto da actividade da endonuclease apurínica/apirimidínica 1 (APE1), a metoxiamina (MX, 10 mM), e um inibidor directo para esta enzima, CRT0044876 (25, 50 e 100 μM). Adicionalmente, foi incluído um inibidor da função redox da APE1, o E3330 (25 e 50 μM). O papel das enzimas polimerase β (Pol β) e poli (ADP-ribose) polimerase 1 (PARP1), envolvidas na BER, foi igualmente estudado, tendo sido escolhidos os inibidores selectivos ácido pamóico (300 μM) e 4-AN (10 μM), respectivamente. Para a ATM foi escolhido o inibidor KU55933 (10 μM). Os resultados obtidos não apresentaram diferenças consideráveis na viabilidade das células expostas à GA na presença de todos os inibidores BER estudados, enquanto que o KU55933 aumentou significantemente a citotoxicidade da GA (1,0 mM, p<0,05), sugerindo a influência da proteína ATM na reparação das lesões de DNA induzidas pela GA.Acrylamide (AA) is a well known toxic agent with several industrial applications. AA has also been found in significant amounts in a wide number of cooked foods. AA has been classified as a probable human carcinogen and both benign and malignant AA-induced breast tumors have been observed in rodents. In addition, there is substantial evidence that glycidamide (GA), an epoxide generated presumably by CYP 2E1 biotransformation, is the ultimate genotoxic agent of AA. However, the mechanisms of DNA repair triggered by GA need further clarification. In this context, the work reported here addresses the effect of DNA repair inhibitors on GA-induced cytotoxic effects in MCF10A human breast epithelial cells. The methodological approach herein used was based on the evaluation of the cell viability of GA-treated cells (MTT assay) in the presence of inhibitors of the Base Excision Repair (BER) and the protein ataxia telangiectasia mutated (ATM), a crucial component of DNA double strand break signalling and regulation. For the BER pathway, methoxyamine (MX, 10 mM), an indirect inhibitor of the apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) activity and CRT0044876 (25, 50 and 100 μM), a direct APE1 inhibitor were used. In addition, E3330 (25 and 50 μM), an inhibitor of the redox function of APE1 was also included in this study. The role of the enzymes polimerase β (Pol β) and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP1), involved in BER, is also subject of analysis, being chosen the selective inhibitors pamoic acid (300 μM) and 4-AN (10 μM), respectivelly. For ATM, the inhibitor KU55933 (10 μM) was chosen. The results obtained revealed no considerable changes in the cell viability presented by GA in the presence of all BER inhibitors studied, whereas KU55933 significantly increased the cytotoxicity of GA (1.0 mM, p