Bactérias de Gram negativo produtoras de β-lactamases e mecanismos moleculares implicados na expressão da resistência à tigeciclina

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013A emergência de bactérias de Gram negativo com resistência aos antibióticos, particularmente, as produtoras de β-lactamases, tem vindo a comprometer as opções de tratamento disponíveis. Este trabalho teve como objetivo avaliar a suscetibilidade e caracterizar os mecanismos de resistência à tigeciclina, pela ação de bombas de efluxo, em 211 isolados de Gram negativo, assim como esclarecer a atividade in vitro deste antibiótico em bactérias com suscetibilidade diminuída a outras classes de antibióticos, sobretudo β-lactâmicos, e com eventual produção de β-lactamases. Os testes de suscetibilidade permitiram identificar 73% de isolados suscetíveis à tigeciclina e 89% com multirresistência, dos quais 70% eram suscetíveis à tigeciclina. Verificou-se ainda uma percentagem elevada de suscetibilidade à colistina e amicacina, bem como de suscetibilidade diminuída aos antibióticos β-lactâmicos, com exceção dos carbapenemes. A caracterização molecular dos mecanismos de resistência aos antibióticos β-lactâmicos, permitiu identificar a produção de β-lactamases: penicilinases, ESBLs da família CTX-M [CTX-M-15-(tipo), CTX-M-1, CTX-M-32 e CTX-M-14], TEM (TEM-4, TEM-10), SHV (SHV-2, SHV-12, SHV-55) e GES (GES-7), bem como carbapenemases (KPC-3) e AmpC (CMY-2, DHA-1, MIR-tipo); 65% destes isolados apresentaram suscetibilidade à tigeciclina. A caracterização molecular dos mecanismos implicados na resistência à tigeciclina, permitiu identificar no gene ramR de 9 dos 20 isolados de Klebsiella pneumoniae com suscetibilidade diminuída àquele antibiótico, uma deleção, uma inserção e de uma a quatro mutações pontuais num mesmo gene, contribuindo para a sobre-expressão da bomba de efluxo AcrAB. No gene marR de 12 isolados de Escherichia coli (5 com e 6 sem suscetibilidade diminuída à tigeciclina), foram detetadas duas mutações pontuais, que sugerem estar associadas à resistência a diversos antibióticos, podendo contribuir para fenótipos de multirresistência. Este estudo evidencia diversidade de β-lactamases, sobretudo ESBL, e emergência de carbapenemases em isolados de Gram negativo. No entanto, estes isolados mantêm uma importante suscetibilidade aos cabapenemes, colistina, amicacina e tigeciclina.The emergence of antibiotic resistant Gram negative bacteria, particularly β-lactamase-producing bacteria, seriously compromises the efficacy of the treatment options available. This study aimed to evaluate the antimicrobial susceptibility, and to characterize the tigecycline resistance due to efflux pump production, in a collection of 211 Gram negative clinical isolates. Moreover, it meant to clarify the in vitro activity of tigecycline against isolates resistant to other antibiotic classes, such as β-lactams, eventually related to β-lactamase production. Susceptibility testing evaluation identified 73% of tigecycline susceptible isolates, and 89% of multidrug resistance, among which 70% were susceptible to this antibiotic. Although there was a high prevalence of β-lactam resistance, carbapenems were still effective against the majority of the isolates studied, as well as colistin and amikacin. Globally, molecular characterization allowed the detection of penicillinases, ESBLs from families CTX-M [CTX-M-15-(type), CTX-M-1, CTX-M-32 and CTX-M-14], TEM (TEM-4, TEM-10), SHV (SHV-2, SHV-12, SHV-55) and GES (GES-7), as well as carbapenemases (KPC-3) and AmpC β-lactamases ( CMY-2, DHA-1, MIR-tipo); among those, 65% were susceptible to tigecycline. The molecular analyses of tigecycline resistance mechanisms revealed one deletion, one insertion and one to four point mutations in the ramR gene that might contribute to the overexpression of AcrAB efflux pump, in 9 out of 20 Klebsiella pneumoniae isolates showing reduced susceptibility. Considering the analyses of the marR gene from 12 Escherichia coli isolates (5 with and 6 without tigecycline resistance), two point mutations were detected, which might be accountable for the resistance to several antimicrobial classes, contributing to multidrug resistance scenarios. This study showed a great diversity of β-lactamases, such as ESBL, and the emergence of carbapenemases in Gram negative bacteria. Nevertheless, the studied isolates still showed decisive susceptibility patterns to carbapenems, colistin, amikacin and tigecycline