Mecanismos de resistência aos antibióticos em bactérias de Gram negativo com susceptibilidade diminuida aos carbapenemes: caracterização laboratorial

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Os carbapenemes são antibióticos β-lactâmicos utilizados como último recurso no tratamento de infeções causadas por bactérias de Gram negativo. Considerando a emergência da resistência a estes antibióticos, importa esclarecer os mecanismos que estão na origem desta diminuição de suscetibilidade. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar, laboratorialmente, os mecanismos responsáveis pela resistência aos carbapenemes em isolados clínicos de Gram negativo, a sua multirresistência, e as vias implicadas na possível disseminação dessa resistência. Dos 426 isolados estudados, foram identificados 22 (5%) com suscetibilidade diminuída ao ertapeneme, os quais foram retidos para a restante investigação. Assim, com os testes de suscetibilidade aos antibióticos realizados, verificou-se que 4% dos isolados apresentavam multirresistência aos antibióticos, tendo ainda permitido predizer mecanismos de resistência responsáveis pelos fenótipos encontrados, e orientar os estudos bioquímicos e moleculares. Estas duas últimas abordagens metodológicas identificaram e caraterizaram a expressão de carbapenemases (3 KPC- 3 e 1 GES-5) e/ou a expressão de β-lactamases de espectro alargado (ESBL) ou AmpC (MIR-tipo). Em 21 isolados foi identificada a alteração aminoacídica das principais porinas (por inserção, deleção e/ou substituição): OmpK35, OmpK36, OmpK37 (Klebsiella pneumoniae), OmpC, OmpF (Escherichia coli, Enterobacter cloacae e Enterobacter cancerogenus), Omp35 e Omp36 (Enterobacter aerogenes). A ESBL predominante foi a β-lactamase CTX-M-15 (n=11) em co-expressão com OXA-1 e TEM-1, bem como a enzima Aac(6’)-Ib-cr (n=8) e OqxAB (n=5); um isolado coexpressava a ESBL SHV-12 e GES-5. Foram identificadas outras β-lactamases, como SHV-1, SHV-11 e SHV-32. Se E. coli pertencia à sequência tipo ST131, estirpe pandémica, já K. pneumoniae apresentou diversidade genética, destacando-se 2 isolados com ST147, disseminado em vários países, e o novo ST1138. Globalmente, este estudo dá um contributo muito importante para o conhecimento dos mecanismos envolvidos na resistência aos carbapenemes (cuja disseminação clonal e horizontal é preocupante), nomeadamente em isolados com multirresistência, realçando-se a resistência plasmídica às fluoroquinolonas.Carbapenems are a group of β-lactam antibiotics that constitute one of the last resorts in the treatment of infections caused by Gram negative bacteria. Considering the emerging rates of resistance to these antibiotics, the investigation of its mechanisms constitutes an important assignment. Thus, this study aimed to characterize the carbapenem resistance mechanisms harbored by Gram negative isolates, the co-resistance to structurally unrelated antibiotics (such as fluoroquinolones), and the features contributing to the potential resistance dissemination. Among the 426 isolated studied, 22 (5%) revealed to be non-susceptible to ertapenem and were consequently retained to further investigations. The antibiotic susceptibility evaluation enabled the prediction of the respective resistance mechanisms and guided the remaining biochemical and molecular studies; it also revealed that 4% of the isolates were multidrug resistant. The last two methodological approaches identified and characterized the expression of carbapenemases (3 KPC-3 and 1 GES-5), extended-spectrum β-lactamases (ESBL) or AmpC (MIR-type). In 21/ 22 isolates, amino acid substitutions were identified (through insertions, deletions or mutations) in the main porins: OmpK35, OmpK36, OmpK37 (Klebsiella pneumoniae), OmpC, OmpF (Escherichia coli, Enterobacter cloacae e Enterobacter cancerogenus), Omp35 and Omp36 (Enterobacter aerogenes). Overall, the main ESBL detected was the CTX-M-15 (n=11), together with OXA-1 and TEM-1, as well as the acetyltransferase Aac(6’)-Ib-cr (n=8) and efflux pump OqxAB (n=5); one of the isolates harbored ESBL SHV-12 and GES-5. Globally, other important β-lactamases, such as SHV-1, SHV-11 e SHV-32, were detected. Moreover, in what regards genetic diversity, E. coli isolates belonged mainly to the pandemic ST131, while K. pneumoniae showed increased ST variety with a focus on internationally disseminated ST147 and the novel ST1138. Globally, this study provides meaningful insights towards the understanding of emergent carbapenem resistance (which is spreading clonally and horizontally), as well as plasmid mediated fluoroquinolone resistance mechanisms, particularly in a worrying multidrug resistant scenario