In vitro assessment of the ability of selected lactic acid bacteria to counteract foodborn pathogenic infections

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Listeria monocytogenes, Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7 are among the most important foodborne pathogens worldwide due to the considerable human rates of illness reported. The role of two selected Lactobacillus spp. strains (LABs), isolated from spontaneously fermenting olive brines, and two probiotic strains, L. casei Shirota and L. rhamnosus GG, in the attenuation of the virulence potential of these foodborne pathogenic bacteria were investigated in this work. The ability of LABs in adhering to the intestinal mucosa and counteracting bacterial infections in the gut was evaluated. Different in vitro tests of virulence, based on animal cells, were used. For the competitive exclusion assays, intestinal human cells (HT-29) were used with L. monocytogenes and Salmonella, in adhesion and invasion assays. With L. monocytogenes, plaque-forming assays (PFAs) were further performed. The cytotoxicity of E. coli O157:H7 Shiga toxins was evaluated by using a cytotoxicity assay based on lactate dehydrogenase release from Vero cells. In the present study, LAB strains showed strong inhibitory effects, with significative reduction (P<0.05) on the virulence potential of Salmonella and L. monocytogenes in adhesion and invasion of HT-29 cells. At the same time, it have been gathered initial evidences which indicating that cell free supernatants from LAB strains significantly reduced (P<0.05) the cytotoxicity produced by one E. coli O157:H7 strain. In conclusion, the results obtained suggest that the Lactobacillus strains tested in this study, L. plantarum and L. paraplantarum, are able to prevent infections by pathogens and can be considered as potential strains for probiotic use with interesting potential in preventing enteric infections in humans.As infecções provocadas pela presença de microrganismos patogénicos, em alimentos e bebidas, são um problema generalizado de saúde pública. Os surtos de origem alimentar envolvem frequentemente Listeria monocytogenes, Escherichia coli e Salmonella enterica. Foram confirmados em 2011, um total de 9.485 casos de infecções de Escherichia coli verotoxinogénicas (VTEC). A maioria destes casos foi causada pelo serogrupo O157. Salmonella foi o género bacteriano mais frequentemente relatado como causador de surtos de origem alimentar em 2011, com 95.548 casos confirmados. Como nos anos anteriores, S. Enteritidis e S. Typhimurium foram os serovares mais frequentemente relatados (44,4% e 24,9%, respectivamente). O número de casos confirmados de listeriose foi 1.476. A listeriose representa a doença de origem alimentar humana mais grave em termos de hospitalização e casos fatais. Escherichia coli é uma bactéria gram-negativa sendo um microrganismo competidor que faz parte do grupo de anaeróbios facultativos mais abundantes da microbiota intestinal animal, colonizando o trato gastrointestinal humano logo após o nascimento. As estirpes pertencentes ao serótipo O157:H7 (EHEC – enterohemorragic E. coli) são responsáveis por inúmeros surtos mundiais. EHEC aderem, inicialmente, à superfície do epitélio intestinal na forma de microcolónias localizadas e, posteriormente, causam uma lesão típica nas células intestinais, denominada attaching and effacing lesion (A/E). Os genes bacterianos responsáveis pela atividade de transdução de sinal são codificados numa ilha de patogenicidade, denominada locus of enterocyte effacement (LEE). Os genes associados com a virulência codificam um sistema de secreção do tipo III (TTSS), promovendo a transferência de moléculas bacterianas efetoras para a célula receptora. Actuam ao nível do cólon e libertam a toxina Shiga (Stx), também designada por verotoxina (VT), cuja absorção sistémica coloca em risco a vida do hospedeiro. EHEC causa diarreia sanguinolenta, colite hemorrágica, síndroma hemolítica urémica e púrpura trombótica trombocitopénica. Salmonella é um outro género da família Enterobacteriaceae. São bactérias gram-negativas, anaeróbias facultativas e não formam esporos. O género Salmonella contém cerca de 2.600 linhagens diferentes, as quais são denominadas de serovares ou serótipos. São diferenciáveis pelos seus antigénios O, H e Vi, utilizando o esquema de Kaufmann-White. Os sintomas característicos de doenças de origem alimentar causadas por Salmonella incluem diarréia, náusea, dor abdominal, febre ligeira e calafrios e, algumas vezes, vómitos, dor de cabeça e fraqueza. Salmonella consegue invadir o intestino pelos mecanismos Zipper e Trigger. A enfermidade é causada pela passagem no lúmen e penetração de células de Salmonella no epitélio do intestino delgado, onde se multiplicam. A seguir, a bactéria invade o íleo e, inclusive, o cólon. A infecção propicia uma resposta inflamatória. Listeria monocytogenes é uma bactéria gram-positiva, não esporulada, não capsulada. É responsável por infecções oportunistas, infectando, preferencialmente, indivíduos com o sistema imunológico comprometido, incluindo mulheres grávidas, recém-nascidos e idosos. L. monocytogenes pode invadir o epitélio gastrointestinal. Uma vez entrando nos monócitos, macrófagos ou leucócitos polimorfos nucleares do hospedeiro a bactéria pode disseminar-se pela corrente sanguínea, levando à septicemia. A sua presença intracelular em células fagocitárias também permite o acesso ao cérebro e provavelmente a migração da placenta para o feto em mulheres grávidas. A patogenicidade de L. monocytogenes baseia-se na habilidade em sobreviver e se multiplicar nas células fagocitárias dos seus hospedeiros. Probióticos são microrganismos vivos, não patogénicos que, quando administrados em quantidades apropriadas, conferem benefício à saúde do hospedeiro. Os mecanismos de acção dos probióticos incluem a aderência ao lúmen intestinal; competição com patogénios para, ligação a receptores, nutrientes e colonização; alteração do pH intestinal, inactivação de toxinas; aprimoramento da função de barreira da mucosa, promoção de respostas imune, inata e adaptativa e elaboração de bacteriocinas. Existe uma quantidade crescente de evidências indicando benefícios para a saúde através do consumo de alimentos contendo probióticos que podem ser usados na prevenção e tratamento de doenças gastrointestinais causadas por microrganismos patogénicos. Este trabalho foi realizado no âmbito do projecto NEW PROTECTION: NativE, Wild PRObioticsTrain EffecCT In Olives in brine (PTDC/AGRALI/117658/2010). O objectivo geral do projecto consiste em confirmar a aplicabilidade de estirpes de Lactobacillus spp. Selecionadas para eventual criação de novos alimentos probióticos a partir de azeitonas. Neste contexto, o objectivo deste trabalho foi investigar o efeito de duas estipes de Lactobacillus spp. (isoladas da fermentação de azeitonas) e de dois probióticos de referência, na atenuação do potencial de virulência de estirpes de Salmonella enterica, L. monocytogenes e E. coli O157:H7. Avaliou-se a capacidade de quatro estirpes de Bactérias Ácido Lácticas (BALs) em aderir à mucosa intestinal e neutralizar infecções bacterianas em células do epitélio intestinal. Utilizaram-se diferentes ensaios de virulência in vitro com cultura de células animais: células de adenocarcinoma do cólon humano (HT-29) e células de rim de macaco verde africano (Vero). Nos ensaios de aderência e/ou invasão avaliou-se o efeito da exclusão competitiva por BALs, sobre três estirpes patogénicas pertencentes a duas espécies bacterianas (Listeria monocytogenes e Salmonella enterica). L. monocytogenes foi também estudada em ensaios de formação de placas de lise (PFA – Plaque Forming Assay). Nos ensaios destinados a investigar a capacidade das BALs na atenuação do potencial virulento das bactérias patogénicas, as células HT-29 foram pré- expostas às BALs por 3 horas. A citotoxicidade das Shiga toxinas de E. coli O157:H7 foi avaliada por meio de um ensaio com base na libertação de lactato desidrogenase (LDH) a partir de células Vero. Avaliou-se o efeito da presença de sobrenadantes de co-culturas de BALs, com E. coli O157:H7 ou das misturas de sobrenadantes de culturas puras BALs com sobrenadante de culturas puras de E. coli O157:H7. Das quatro estirpes estudadas de BALs, duas correspondem a probióticos de referência (Lactobacillus casei e Lactobacillus rhamnosus) e duas estirpes (LB95 e LB13) estão a ser avaliadas relativamente às suas características probióticas. No presente estudo, as estirpes de Lactobacillus mostraram fortes efeitos inibidores, com redução significativa (P<0,05) no potencial de virulência de Salmonella e de L. monocytogenes em ensaios de exclusão competitiva usando células HT-29. Ao mesmo tempo, foram recolhidas evidências que indicam que os sobrenadantes de BALs reduziram significativamente (P