Métodos de diagnóstico em microbiologia alimentar: uma abordagem molecular

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012O estudo da microbiota dos alimentos assume um papel cada vez mais importante na sociedade actual, permitindo a concepção de mecanismos para diminuir a incidência e a prevalência de bactérias patogénicas como Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7 ou Listeria monocytogenes. Existem muitos procedimentos padronizados para a detecção presuntiva destes microrganismos nos alimentos baseada na análise de caracteres fenotípicos, publicados pela International Organization for Standardization. No entanto, a sua maioria revela-se dispendiosa e demorada com resultados, por vezes, inconclusivos. Os métodos de diagnóstico molecular, como o PCR em multiplex (mPCR), têm-se revelado de enorme interesse para a microbiologia alimentar pois permitem obter resultados fiáveis, rápidos e muitas vezes com um custo menor. Neste trabalho, foram desenvolvidos e optimizados procedimentos baseados em mPCR para a detecção de Salmonella spp.; L. monocytogenes; E. coli (O157:H7 e VTEC); Campylobacter spp. e Vibrio spp. A optimização desses métodos permitiu estabelecer boas condições para a amplificação dos alvos específicos. Foi também desenvolvido um esquema de “genoserotipificação” que permitiu detectar eficazmente os serotipos Salmonella Typhimurium, Salmonella 1,4,[5],12:i:- e Salmonella Enteritidis. Posteriormente, a performance dos mPCR foi avaliada com recurso ao cálculo de parâmetros de avaliação recomendados. Todos os métodos revelaram possuir bons potenciais de detecção, tendo percentagens de especificidade, sensibilidade e fidelidade sempre superiores a 90%, e em muitos casos de 100%, o que os permite classificar como específicos, sensíveis e exactos. Além disso, praticamente todos os métodos demonstraram possuir um baixo limite de detecção, inferior 100 pg/µl. Por fim, para alguns desses métodos foi desenvolvido um protocolo que permite a detecção de Salmonella spp., L. monocytogenes e E. coli por PCR directamente após enriquecimento primário. Os ensaios demonstraram que é possível detectar os microrganismos em questão, desde que a sua carga microbiana inicial seja igual ou superior a 1 cfu/ml, o que permitiu concluir tratar-se de uma boa abordagem. Assim, com este trabalho, foi possível desenvolver protocolos para a prestação de serviços pela Biopremier, SA que seguem uma abordagem molecular, alternativamente aos métodos actualmente usados para o estudo da microbiologia dos alimentos.The study of foodborne pathogens is of major importance in today’s society. In order to decrease the worldwide incidence and prevalence of bacteria like Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7 or Listeria monocytogenes several phenotypic-based detection standard methods have been published by the International Organization for Standardization. However, mostly are expensive, time-consuming and at times with inconclusive results. Molecular diagnostic methods, such as multiplex PCR, proved to be of great interest for food microbiology analysis as they provide less-time, reliable and often lower cost results. In this work were developed and optimized mPCR-based procedures in order to detect Salmonella spp., L. monocytogenes, E. coli (O157:H7 and VTEC), Campylobacter spp. and Vibrio spp. A “genoserotipification” scheme allowing the efficient detection of serotypes Salmonella Typhimurium, atypical monophasic Salmonella 1,4,[5],12:i:- and Salmonella Enteritidis was also developed. As recommended, some analytical parameters were calculated to evaluate the performance of the methods. A good detection potential with values of specificity, sensitivity and fidelity greater than 90%, often of 100%, were obtained. Furthermore, all diagnostic methods showed a DNA detection limit lower than 100 pg/µl. Salmonella spp., L. monocytogenes and E. coli protocols for direct PCR detection after primary enrichment were developed. The performed assays revealed that the target detection is possible, as long as the initial microbial concentration is equal to or greater than 1 cfu/ml. Therefore, as outcome of this work 10 different protocols were designed and tested and are in use or intend to be routinely used in services provided by Biopremier, SA as an alternative molecular approach to the currently used diagnostic methods to study the food microbiology