The role of microRNA-20a in the TGFβ-ALK5-Smad2/3 signaling pathway and ability to unihibit the Endothelial-Mesenchymal transition

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Ao longo das últimas décadas as doenças cardiovasculares têm vindo a aumentar a sua incidência, sendo das doenças que mais mortes provocam a nível mundial. Este grupo de doenças é caracterizado por distúrbios causados ao nível do aparelho cardiovascular, principalmente no endotélio vascular. O endotélio vascular é constituido por uma monocamanda de células endoteliais, formando a face interna de todos os vasos sanguíneos. Devido ao seu contacto directo com a corrente sanguínea, as células endoteliais são extremamente importantes, regulando as trocas que ocorrem entre a corrente sanguínea e os tecidos envolventes. São células extremamente versáteis e multifuncionais, apresentando um conjunto de propriedades sintéticas e metabólicas, entre as quais podemos englobar a regulação da trombose e trombólise, aderência das plaquetas, modulação do tônus muscular e da corrente sanguínea, e regulação de respostas imunitárias e inflamatórias através do controlo da interação dos leucócitos, monócitos e linfócitos, com a parede do vaso sanguíneo. Sendo as funções das células endoteliais essenciais para a manutenção e bom funcionamento do sistema vascular, disfunções endoteliais promove o desenvolvimento de difunções vasculares levando posteriormente a lesões cardíacas. Muitas destas lesões cardíacas acabam numa via final comum de remodelação do tecido patológico e fibrose cardíaca, conduzindo ao desenvolvimento de insuficiência cardíaca. A fibrose cardíaca é definida pela deposição de colagénio, elastina, tenascina, entre outras proteínas da matriz, e é induzida pelos fibroblastos cardíacos, que têm um papel importante na remodelação cardíaca após a lesão. Apesar de a fibrose cardíaca apresentar importante papel na cicatrização de lesões, também contribui para o enrijecimento ventricular e para a progressão de falha cardíaca. Actualmente sabe-se que os fibroblastos cardíacos são originados através da transição mesenquimal das células endoteliais que é denominada de transição endotelial-mesenquimal (EndMT; Endothelial-to-Mesenchymal Transition). EndMT é um fenómeno biológico complexo que ocorre quando as células endoteliais perdem os seus marcadores específicos, como é o caso da caderina-endotelial vascular (VE-Cadherin; Vascular Endothelial Cadherin), e adquirem fenótipos mesenquimais ao expressar marcadores mesenquimais específicos, como é o caso de alfa actina do músculo liso (SMA; alpha-Smooth Muscle Actin) e colagénio tipo I. EndMT resulta na diminuição do número de células endoteliais e no aumento da produção de colagénio e miofibroblastos, que leva consequentemente a doenças de proliferação vascular. Numa fase embrionária, a EndMT é necessária para uma normal morfogénese valvular e septal a partir da prévia formação do coxim-endocárdico, processo dependente da diferenciação das células endoteliais em células mesenquimais e que tem como principal indutor deste processo o factor de crescimento TGFβ (transforming growth factor-β). Durante o processo de desenvolvimento celular existem diferentes vias de sinalização que são essenciais. A via de sinalização do TGFβ é especialmente importante uma vez que é igualmente essencial tanto para o desenvolvimento embrionário como na manutenção da homeostase tecidular. O TGFβ pertence a uma superfamília de péptidos multifuncionais que regulam muitos processos no desenvolvimento celular, como a proliferação, diferenciação, adesão, migração e muitas outras funções em diferentes tipos de células. Alteração na sinalização do TGFβ origina malformações congénitas, inflamação e cancro. Os membros da família TGFβ ligam-se a dois tipos de receptores proteicos de serina/treonina quinase, receptores TGFβ do tipo I (TGFβR1 ou ALK5) e receptores TGFβ do tipo II (TGFβR2). Aquando a ligação do ligando TGFβ, TGFβR2 é activado e por sua vez vai fosforalizar ALK5, que leva à activação de cascatas de transdução do sinal, incluindo as vias Smad. As vias Smad regulam a transcrição de genes alvo, através da interacção com vários cofactores nucleares que regulam a transcrição dos mesmos. A fosforilação e activação do Smad2 e Smad3 induz a interação com a Smad4 de modo que entram no núcleo para regularem a expressão genética. O TGFβ pode ser regulado positiva e negativamente por numerosos microRNAs, em que muitos deles têm vindo a ser investigados intensivamente. A descoberta dos miRNAs e a dos seus mRNAs-alvo permitiu o desenvolvimento de novos mecanismos da expressão genética. Os miRNAs são pequenos fragmentos de RNA não-codificante, aproximadamente 22 nucleótidos, que inibem a produção proteica através da repressão translacional ou da degradação/clivagem do mRNA-alvo. Os miRNAs ligam-se na região não codificante, 3’UTR (untranslated region) de diversos mRNA através do emparelhamento com pares base imperfeitos, regulando um conjunto de cascatas de transdução de sinal, como a sinalização de TGFβ-ALK5-Smad2/3. Os miRNAs são extremamente importantes uma vez que estão envolvidos em diversos processos biológicos como desenvolvimento, diferenciação, proliferação celular, metabolismo e apoptose. Eles são dos pricipais responsáveis para manter homeostase de diversos tipos de sistemas, como o sistema cardiovascular. O principal objectivo deste trabalho foi investigar a capacidade do miRNA20a (miR20a) inibir a via de sinalização TGFβ-ALK5-Smad2/3 e deste modo inibir EndMT. Estudos prévios realizados pelo nosso grupo de investigação foi verificou a existência de uma ligação entre TGFβ1 no EndMT, que leva ao aumento da expressão de SM22α (smooth muscle protein 22 alpha). Inicialmente, células endoteliais humanas do cordão umbilical (HUVEC) foram isoladas e estimuladas com TGFβ1 de modo a induzir EndMT. Caracterização da expressão do marcador endotelial, VE-Cadherin, e da expressão do marcador mesenquimal, SM22α, foi feita através de análise por imunofluorescência, assim como os níveis de expressão proteica dos principais alvos desta via de sinalização foram validados por Western Blot. Não havendo qualquer documentação relativo aos mRNA-alvo do miR20a nesta via de sinalização, foi realizado o ensaio Luciferase, para determinar esses mesmos alvos. Células HEK foram transfectadas com 3’-UTR dos genes de interesse na presença ou ausência do miR20a ou controlo (miR608). Foi verificado que miR20a consegue-se ligar a quase todos os mRNAs dos genes de interesse, tendo maior afinidade para os receptores de TGFβ (TGFβR2 e ALK5), SARA e Smad2. Sabendo que miR20a se consegue ligar a quase todos os genes de interesse da via de sinalização TGFβ-ALK5-Smad2/3, induziu-se a expressão genética do miR20a em HUVECs. Com a expressão genética do miR20a aumentada, foi possivel analisar a capacidade deste miRNA em inibir esta via de sinalização do TGFβ. Verificou-se que as células endoteliais, aquando a sua indução com miR20a, conseguem manter as suas propriedades funcionais apresentado as mesmas caracteristicas que o seu controlo. Este resultado prova-nos que miR20a consegue inibir EndMT e essa inibição ocorre devido à ligação do miR20a ao mRNA de TGFβR2, ALK5, SARA ou Smad2. De modo a desvendar o processo molecular pelo qual miR20a é expresso nas células endoteliais, estimulamos HUVEC com TGFβ1 e com diferentes factores de crescimento. Através da análise da expressão do miR20a nestas células, foi possível verificar que o factor de crescimento bFGF é o factor de crescimento que leva ao aumento da expressão de miR20a nas células endoteliais. Deste mode, analisando as diferentes vias de sinalização de bFGF e induzindo HUVEC com TGFβ1, bFGF e com inibidores dessas vias de sinalização, foi possivel verificar que a expressão de miR20a ocorre por via de JNK ou bFGF mediado por JNK ou Erk1/2. Os resultados adquiridos neste trabalho experimental são de grande interesse para a comuidade cientifica, sendo um base fundamental para futuros trabalhos cientificos mais direccionados para a clínica, de modo a poder contribuir para introdução de terapeutica para o tratamento de doenças cardiovasculares nas quais EndMT está envolvido.Endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) is a biological process that occurs in advantages stages of endothelial dysfunction and is characterized by decreased expression of endothelial cell markers and functions, together with increased expression of mesenchymal markers and functions. EndMT results in a decreased number of endothelial cells and increase of (myo)fibroblasts, which leads to scar formation in the cardiovascular tissues. EndMT is induced by TGFβ1. Stimulation of endothelial cells with TGFβ1 activates its receptor, ALK5, causing activation of Smad2/3 which results in the induction of mesenchymal genes. MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenous, small non-coding RNAs (~22 nucleotides) that regulate gene translation. The TGFβ signaling cascade can be regulated by many microRNAs, among them miRNA-20a (miR20a). We investigated if miR20a can inhibit TGFβ-ALK5-Smad2/3 signaling and is thereby able to inhibit the process of EndMT. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were stimulated with TGFβ1 to induce EndMT, leading to an increased expression of SM22α and decreased expression of endothelial marker, VE-Cadherin. Protein expression levels were validated by western blot and had higher levels in the TBFβ receptors and downstream mediators. By expressing miR20a in HUVECs, we could identify miR20a target genes and investigate the influence of miR20a expression on EndMT. MiR20a is rapidly downregulated when endothelial cells are stimulated with TGFβ1, which coincides with EndMT. VE-Cadherin expression decreased, causing loss of endothelial barrier function, while mesenchymal marker SM22α increased drastically, leading to an aberrant change in cell morphology, e.g. cellular hypertrophy. Ectopic expression of miR20a decreased HUVEC sensitivity to TGFβ1 through targeting TGFβR2, ALK5 and SARA, and abrogated EndMT, as observed by maintenance of VE-Cadherin and inhibition of SM22α expression