Membranes as targets for apoptotic bile acids

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012Ácidos biliares (ABs) são derivados do colesterol sintetizados no fígado, cuja função é solubilizar lípidos durante a digestão. Este grupo é composto por vários moléculas que variam no número e posições dos grupos hidroxilo e no seu grupo terminal. Os ácidos biliares são caracterizados consoante a sua hidrofobicidade. Os ABs hidrófobos (como o ácido deoxicólico, DCA) são activadores de apoptose tanto por via extrínseca, induzindo a activação de receptores de morte, como por via intrínseca, promovendo a libertação de factores pro-apoptóticos dos mitocôndrios. Por outro lado, os ABs hidrófilos (como os ácidos ursodeoxicólico, UDCA, e tauroursodeoxicólico, TUDCA) são inibidores da apoptose, inibindo os eventos acima descritos. No entanto, o mecanismo através do qual os ABs induzem respostas antagónicas ainda não está elucidado. Neste trabalho é posta a hipótese que a membranas celulares constituem o alvo principal na sinalização pró-apoptótica. Adicionalmente, o trabalho segue também três linhas de investigação que tentam esclarecer qual o efeito citoprotector dos ABs hidrófilos: 1) os ABs hidrófilos e hidrófobos interactuam em solução dando origem a um agregado misto que é inócuo para as células; 2) os ABs hidrófilos impedem a partição e interacção dos ABs hidrófobos com membranas; 3) os ABs hidrófilos alteram a dinâmica das membranas celulares impedindo ou revertendo possíveis alterações induzidas por ABs hidrófobos. Foram utilizados os ABs DCA, UDCA e TUDCA, bem como dois ABs derivados com o grupo fluorescente nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4yl (NBD), DCA-NBD e UDCA-NBD. Em primeiro lugar e com o objectivo de testar o comportamento dos derivados de ABs, a concentração micelar crítica dos ácidos biliares não marcados foi determinada usando como sondas os ABs derivatizados ou Nile Red, uma sonda hidrófoba. Observou-se que tanto os derivados de ABs como o Nile Red detectavam micelas de ABs de forma semelhante. No entanto, a formação de micelas de ABs foi detectada a concentrações mais baixas quando os ABs derivatizados foram utilizados. Isto indica que os ABs derivatizados têm maior afinidade para micelas de AB que outras sondas hidrófobas. De seguida, o comportamento dos ABs derivatizados foi estudado em solução aquosa. Foi observado que os dois derivados de fluorescentes agregavam em solução aquosa a concentrações superiores a 2 μM. Provou-se que esta agregação é induzida pelo grupo NBD, o que indica que a derivatização, ao retirar à molécula um grupo carregado negativamente, induz agregação. Ainda assim, foi observado que ABs hidrófilos (não marcados) interagem com DCA-NBD na gama de concentrações em que estas moléculas apresentam um efeito citoprotector. Utilizando um modelo matemático, foram ajustadas constantes de agregação aos dados de fluorescência em função da concentração de DCA-NBD na presença e na ausência de Abs hidrófilos. O modelo recuperou uma constante de agregação de DCA-NBD com ABs hidrófilos na ordem dos 0.002-0.004 μM-1. Estes valores indicam uma interacção muito fraca entre DCA-NBD e UDCA ou TUDCA. Tendo em conta que o DCA-NBD é mais susceptível à formação de agregados que o DCA, podemos concluir que o efeito citoprotector dos ABs hidrófilos não se deve à formação de um complexo inerte hidrófilo/hidrófobo em solução. A partição dos derivados de ABs para membranas modelo foi também estudada. Para isso foram utilizados dois tipos de vesículas compostas apenas por POPC ou por POPC, colesterol e PSM. Notou-se que tanto DCA-NBD como UDCA-NBD particionavam de forma análoga para vesículas constituídas apenas por POPC e que particionavam com menor eficácia para vesículas contendo uma mistura de POPC, colesterol e PSM (mistura lipídica com coexistência de fases liquido ordenadas, lo, e desordenadas, ld). A partição de UDCA-NBD e DCA-NBD foi dramaticamente afectada pela presença de fases ordenadas. Devido à interacção detectada entre DCA-NBD e ABs hidrófilos, a partição do DCA-NBD para vesículas de POPC foi de novo analisada após incubar as vesículas com elevadas concentrações de ABs hidrófilos. Foi observado que a partição do DCA-NBD não era alterada pela presença de ABs hidrófilos. O efeito de ABs não marcados nas propriedades biofísicas de sistemas modelo de membranas foi também estudado. Neste conjunto de experiências, várias sondas de membrana foram incorporadas nas vesículas, cada uma monitorizando uma propriedade biofísica diferente, desde fluidez de diferentes regiões ao potencial de membrana. Foi observado que a sonda DPH era insensível à presença de ABs mas que a sonda ANEPPDHQ aumentava o seu rendimento quântico na presença destas moléculas. Sendo o DPH (uma sonda de fluidez do interior da membrana) insensível aos ABS e o ANEPPDHQ (uma sonda mais superficial) sensível aos ABs, conclui-se que a possível localização dos ácidos biliares é à superfície da membrana. Por outro lado, foi observado que o aumento a concentração de colesterol nas membranas não era acompanhado pelo aumento de rigidez na presença de DCA. No entanto, o efeito medido não era inibido por ABs hidrofílos. Foi provado que este efeito não era devido à remoção de colesterol por DCA, pois a sonda dehidroergosterol, um análogo fluorescente do colesterol, não era removido das vesículas pelo AB. Conclui-se portanto que o DCA em concentrações submicelares elimina parcialmente a capacidade do colesterol de rigidificar membranas. Este efeito não é observado em fase lo. Adicionalmente, foi observado um aumento considerável da área superficial de membranas após incubação com DCA. A exposição de membranas biológicas ao DCA poderá assim resultar numa alteração significativa das suas propriedades biofísicas. Finalmente, células HEK293 foram incubadas com DCA ou TUDCA ou uma combinação dos dois ABs. As células, marcadas anteriormente com ANEPPDHQ, foram analisadas por FLIM de modo a estudar o efeito dos ABs in vivo. Foi observado que o tempo de vida da sonda ANEPPDHQ diminuía após incubação com os ABs. Estes resultados diferem dos obtidos em sistemas modelo, em que era observado um aumento no tempo de vida desta sonda. Esta discrepância pode ser explicada pela presença de diferentes membranas, com diferentes composições num sistema vivo, ou por um efeito da activação da via apoptótica nas células. É possível que os ABs tenham efeitos diferentes em membranas com composições diferentes, o que explicaria a discrepância observada. Concluindo, neste estudo foi observado que DCA-NBD e UDCA-NBD agregam em solução aquosa e que particionam de forma semelhante e preferencial para fases ld. A partição de DCA-NBD não é afectada por ABs hidrófilos. Através de estudos utilizando sondas de membrana, concluiu-se que a posição de ABs em membranas é possivelmente superficial. A observação de que o DCA elimina parcialmente a capacidade do colesterol de rigidificar membranas, foi de particular importância para a elucidação do mecanismo apoptótico destas moléculas. Este poderá assim estar relacionado com uma alteração na organização dos componentes da membrana plasmática, nomeadamente a nível da formação/composição de jangadas lipídicas. Por último, o efeito dos ABs em células foi estudado e é aparentemente diferente do observado em sistemas modelo, indicando que em células vidas, a eliminação parcial do efeito rigidificante do colesterol não é o único efeito na estrutura de membranas biológicas resultante da incubação com ácidos biliares hidrófobos.Bile acids (BAs) are cholesterol derivates synthetized in the liver of humans. Hydrophobic bile acids (BAs) such as deoxycholic acid (DCA) induce cell death via multiple pathways, including the extrinsic pathway of apoptosis, dependent on pro-apoptotic receptor activation in the plasma membrane, and the intrinsic pathway of apoptosis, involving the release of pro-apoptotic factors from mitochondria. In turn, it has been shown that hydrophilic BAs, particularly ursodeoxycholic (UDCA) and tauroursodeoxycholic (TUDCA) acids significantly inhibit most of these events, thereby preventing apoptosis. Still, the mechanisms by which BAs trigger such opposite signaling effects remain unclear. We hypothesize that cellular membranes may constitute a determinant primary target for the modulatory effects of BAs during apoptosis. In this work, two nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4yl (NBD) fluorescent derivatives of DCA and UDCA, namely DCA-NBD and UDCA-NBD were studied. Both DCA-NBD and UDCA-NBD interacted with micellar and pre-micellar aggregates of the unlabeled molecules. Interestingly, unlabeled hydrophilic BAs UDCA and TUDCA interacted weakly with DCA-NBD at pre-micellar concentrations. In addition, both probes partitioned effectively and in similar extent to model membranes (POPC liposomes) and were sensitive to the presence of cholesterol in the membrane. Although UDCA and TUDCA interacted with DCA-NBD, these interactions did not change DCA-NBD partition properties. Unlabeled BAs DCA, UDCA and TUDCA were shown to induce changes in the fluorescence properties of superficially-located membrane probes, which indicate a superficial but strong interaction with membranes. Lastly, DCA limited to some extent the rigidifying effect of cholesterol on the lipid membrane. This effect could not be abrogated by hydrophilic BAs and might correlate with the apoptotic effect of hydrophilic BAs on cells. Lastly, FLIM was performed on ANEPPDHQ-labeled HEK293 cells with different results than in membrane model systems, suggesting that effects on biological membranes are not limited to the inhibition of the cholesterol rigidifying effect