Efeito da administração de enzimossomas de superóxido dismutase na lesão de reperfusão do fígado: estudos num modelo animal de isquémia/reperfusão

Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012A lesão de isquémia/reperfusão do fígado ocorre em inúmeros contextos clínicos, nomeadamente em transplantes, e apresenta taxas significativas de morbilidade e mortalidade. A formação de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e a subsequente reoxigenação do fígado danificam os tecidos e iniciam cascatas celular que conduzem a uma resposta inflamatória aguda, morte celular e, em última instância, à insuficiência e falha do órgão. Vários investigadores têm desenhado tratamentos com alta potencialidade, baseados na remoção das ROS através da administração de enzimas antioxidantes, tais como o superóxido dismutase (SOD). Este enzima apresenta um perfil farmacocinético pouco favorável, uma vez que ao ser administrado apresenta um curto tempo de vida no plasma (6 a 12 minutos) e uma rápida remoção renal via filtração glomerular. Uma forma de contornar estes problemas é promover a sua associação a um sistema de transporte - os lipossomas- capaz de manter a estrutura e atividade proteica, alterando a sua farmacocinética e entregando-as ao tecido alvo de forma segura, e conseguindo melhorar a eficácia de fármacos proteicos. Nos enzimossomas de SOD utilizados neste trabalho, o enzima terapêutico encontra-se ligado covalentemente à superfície exterior da bicamada do lipossoma, a qual está revestida com PEG. Foi comparada a sua eficácia terapêutica quer com o enzima na forma solúvel quer encapsulado no espaço interno aquoso de lipossomas de longo tempo de circulação (igualmente revestido com PEG). Neste estudo observou-se que a eficácia de incorporação da proteína na vesícula lipídica varia de lipossomas para enzimossomas, sendo que nesta última formulação o fato de a proteína se encontrar ligada covalentemente à bicamada lipídica, através de um lípido modificado (Maleimida-PEG-PE), aumenta este parâmetro de 9 para 25%. O método de preparação é um fator que condiciona a eficácia de encapsulação/conjugação da proteína à vesícula lipídica. Assim, para os lipossomas recorreu-se ao mátodo de desidratação-rehidratação (DRV) que ajuda a aumentar a eficácia de encapsulação do SOD nos lipossomas. Contudo, o processo de extrusão diminui a eficácia de encapsulação do SOD, uma vez que durante a extrusão os lipossomas rompem e o SOD tem tendência a escapar do espaço interno aquoso para a fase externa. Na preparação de enzimossomas, o método escolhido foi o MLV (suspensão de um filme lipídico numa solução aquosa), obtendo-se vesículas multilamelares. Quanto ao tamanho das vesículas, o seu dimensionamento foi realizado através do processo de extrusão usando filtros de porosidade adequada. No entanto, neste caso este processo não é crítico para a retenção de enzima dado que a associação deste é feita posteriormente. Desta forma, e sabendo que o tamanho é um fator determinante no sucesso de entrega do fármaco ao seu local alvo, obtiveram-se partículas com diametro médio 0,15 µm para ambas as formulações, condição ideal para que atinjam os locais de inflamação originados pela situação de I/R hepática. Foram ainda otimizados vários procedimentos experimentais como a cirurgia de indução da isquémia/reperfusão bem como os tempos de isquémia e posterior recolha de amostras de sangue e de fígado. Assim, optou-se por se realizar os estudos in vivo em animais com isquémia induzida durante 30 minutos, e posterior sacrifício para recolha das amostras de sangue e fígado, 24 horas após a cirurgia. A recolha de amostras de sangue permitiu uma análise bioquímica, nomeadamente a atividade de vários enzimas hepáticos (aspartato transaminase, alanina transaminase, fosfatase alcalino e ƴ-glutamiltransferase) que deveriam apresentar níveis de atividade semelhantes aos animais controlo, após tratamento, ou seja, após administração de SOD. A atividade do aspartato transaminase foi a que mais alterou com a isquémia e com a administração das formulações. Quanto à inversão leucocitária e à análise patológica foram ambas inconclusivas. Os extratos proteicos hepáticos correspondentes quer à fração nuclear, quer à fração citosólica, foram analisados por SDS-PAGE seguido de western-blot, de modo a quantificar os níveis de NF- ҡB e IҡBα. Este ponto de estudo foi também ele inconclusivo, uma vez que não se observaram diferenças significativas nos níveis de ativação de NF- ҡB e IҡBα. Para isso será necessário efectuar no futuro a análise de mais extratos proteicos. Igualmente importante para se ter um melhor retrato do processo de isquémica/reperfusão no fígado e da sua terapêutica será o uso de diferentes tempos de isquémia e de recolha das amostras de fígado.Liver ischemia/reperfusion (I/R) injury occurs in several clinical settings, particularly in transplants, and has significant rates of morbidity and mortality. The formation of reactive oxygen species (ROS) and subsequent reoxygenation damages the liver and initiates cellular cascades that lead to an acute inflammatory response, cell death, and ultimately to failure and organ failure. Several researchers have designed treatments with high potential based on the removal of ROS by administration of antioxidant enzymes such as superoxide dismutase (SOD). This enzyme has a very unfavorable pharmacokinetic profile, since it has a short life in plasma (6-12 min) and rapid removal via renal glomerular filtration. One way around these problems is to promote its association with a transport system – liposomes- able to maintain the structure and activity of proteins, altering their pharmacokinetics and delivering them to the target tissue safely, and getting improve the efficiency of protein pharmaceuticals. In the SOD enzymosomes used in this work, the therapeutic enzyme is covalently linked to the outer surface of the liposome bilayer which is coated with PEG. The therapeutic activity of SOD enzymosomes was compared either with free SOD or SOD encapsulated in the inner aqueous space of long circulating liposomes (also coated with PEG) In this study we observed that the incorporation efficiency of SOD in the lipid vesicle of the liposomes varies for enzymosomes, whereas in the latter formulation the covalently bounding of the protein to the lipid bilayer, via a modified lipid (PEG-maleimide- PE), increases this parameter from 9 to 25%. The method of preparation is a factor that affects the entrapment efficiency / conjugation of the protein to lipid vesicle. Thus, in the production of liposomes, the procedure used was dehydration-rehydration (DRV) which helps to increase the encapsulation efficiency of SOD in liposomes. However, the extrusion process decreases the efficiency of encapsulation of SOD since, during extrusion, liposomes rupture and SOD tends to escape from the inner space to the aqueous external phase. The method chosen for the preparation of enzymosomes was the MLV method (suspension of a lipid film in an aqueous solution), whereby multilammellar vesicles were obtained. Regarding the size of the vesicles, their sizing was performed by extrusion using appropriate filters. Knowing that this is a determining factor in the successful delivery of the drug to its target site, we obtained particles with average size of 0.15 µm for both formulations, a size ideal for reaching the sites of inflammation generated by the liver I/R situation. Several experimental procedures such as the surgery for induction of ischemia / reperfusion as well as the time of ischemia and subsequent collection of blood and liver samples were optimized. Thus, we choose to perform in vivo studies in animals with induced ischemia for 30 minutes, and sacrifice them 24 hours after surgery for collection of blood samples and liver. The collection of blood samples allowed a biochemical analysis, including the activities of various liver enzymes (aspartate transaminase, alanine transaminase, alkaline phosphatase and ƴ-glutamyltransferase) that should exhibit activity levels similar to control animals after the administration of SOD. Aspartate transaminase activity was the most affected with ischemia and administration of the formulations. As regards to the leukocyte reversal and pathological analysis both were inconclusive. Protein hepatic extracts of the nuclear and cytosolic fraction were analyzed by SDS-PAGE followed by western-blot in order to quantify the levels of NF- ҡB and IҡBα. The results were also inconclusive since no significant differences were observed in levels of activated NF- ҡB and IҡBα between the animal groups in part due to a high dispersion in the values obtained and the small number samples analyzed. Further studies will be needed in order to increase the number of samples analyzed to reach conclusions. Also, to get a better picture of the liver I/R process and its therapeutics it will be important to test different times of ischemia and of collecting the liver samples