Study of the mechanism of action of the antimicrobial peptide rBPI21 in gram-negative bacteria

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2012Antimicrobial peptides (AMPs) are currently looked as new candidates to overcome the bacterial resistance against therapeutic antibiotics. However, their mechanism of action remains unclear, despite several theories having been proposed. The understanding of the processes that govern AMPs activity is the best way to provide rational design of new antibiotics for further clinical use against bacterial infections. Human AMPs are part of the innate immune system and synthetic versions of these AMPs are good candidates, due to their low toxicity and high antimicrobial activity. It is believed that the mode of action of these AMPs involves their action at the membrane level. This thesis is focused on the study of the interaction of a fragment based on the N-terminal region of a human antimicrobial protein, the bactericidal/permeability increasing protein (BPI), with biomembrane model systems and bacterial cells. The fragment, named rBPI21, has antimicrobial properties and neutralizes the effect of the lipopolysaccharide (LPS) during bacterial infections. The thesis describes the use of biophysical strategies in order to unravel the fundamental steps involved in the bactericidal activity of rBPI21. Membrane selectivity was quantified using a range of biophysical techniques and reported in Chapters III and V. Chapter III reveals that rBPI21 prefers negatively charged liposome systems containing phosphatidylglycerol, which mimic bacterial membranes. The preference for the anionic phosphatidylglycerol membranes is followed by membrane aggregation/fusion and, at higher rBPI21 concentrations, there is a leakage of liposome content, as described in Chapter IV. Liposomes fusion leads to multilamellar membrane structures, as studied in Chapter V by small angle X-ray scattering. Previous studies revealed that rBPI21 was able to induce membrane perturbations on negatively charged membrane model systems mimicking the membranes of bacteria. On the other hand, membrane model systems that mimic eukaryotic membranes remain unaffected by the presence of rBPI21. In Chapter VI, the interaction of rBPI21 with bacteria was studied using atomic force microscopy, and the results were correlated with those obtained with membrane model systems in order to unravel the possible mechanism of action of the peptide. rBPI21 was shown to induce membrane perturbations, culminating in bacterial cells content leakage, both on the Gram-negative bacteria Escherichia coli and on the Gram-positive Staphylococcus aureus. The interaction of rBPI21 with bacteria was decreased in the presence of free lipopolysaccharide aggregates, demonstrating the affinity of rBPI21 for free LPS, as studied by force spectroscopy. The overall observed results potentiate the use of the rBPI21 in clinics against bacterial infections. Also, the development of new synthetic peptides based on rBPI21 structure is a valuable route to develop new therapeutic agents with antibacterial properties.O aumento considerável das resistências bacterianas aos antibióticos em uso na prática clínica têm vindo a deixar as comunidades científica e clínica, alarmadas. O desenvolvimento de novas classes de antibióticos é urgente, para que se possa combater a resistência bacteriana adquirida. Os péptidos antibacterianos são vistos como novos candidatos para uso terapêutico nesta área. No entanto, ainda existem dúvidas e necessidades de esclarecimento quanto ao seu mecanismo de acção. A aquisição deste conhecimento, ainda em falta, irá permitir o desenvolvimento de novos péptidos para uso clínico contra infeções bacterianas e a optimização das suas aplicações e modo de administração. Os péptidos antibacterianos podem-se encontrar em quase todos os organismos vivos expostos à ação dos micróbios, desde os humanos até plantas e insetos. Estes agentes fazem parte da resposta rápida e eficaz contra patogénios. No caso dos humanos, o sistema imune inato é rico em péptidos antibacterianos, o que faz destes agentes bons candidatos para terapêutica, devido à baixa toxicidade e elevada actividade antibacteriana. A maioria dos péptidos antibacterianos são caracterizados principalmente por, em condições fisiológicas, possuírem carga global positiva devido à presença na sua constituição de grande quantidade de aminoácidos catiónicos, como é o caso de argininas e lisinas. É também conhecida a tendência para estas moléculas adquirirem uma estrutura anfipática, ou seja, são moléculas que apresentam uma região hidrófila e uma outra hidrófoba. Em concordância com estas características, estudos demonstram que a actividade antibacteriana destes péptidos ocorre maioritariamente ao nível da membrana. A selectividade destes agentes para as bactérias em detrimento das células humanas, por exemplo, deve-se sobretudo à presença de algumas moléculas específicas na superfície das bactérias, como é o caso dos lipopolissacáridos, e também de uma elevada percentagem de fosfolípidos aniónicos na membrana. É a carga negativa da membrana que potencia a atracão electrostática entre os péptidos antibacterianos e as membranas das bactérias. ação antibacteriana destes agentes ao nível das membranas das bactérias faz com que seja difícil para as bactérias adquirirem resistência. Isto implicaria alterações significativas na constituição membranar, o que levaria a uma alteração no potencial de membrana com custos energéticos e funcionais para a bactéria. De forma a desenvolver os péptidos antibacterianos como fármacos é necessário o estudo pormenorizado da ação dos mesmos em membranas. No entanto, as membranas biológicas são sistemas muito complexos para poderem ser usados na análise da actividade dos péptidos antibacterianos. Uma alternativa comummente usada e bastante viável prende-se com o uso de sistema modelo de membranas, nomeadamente o uso de vesículas lipídicas. É possível usar diferentes misturas de lípidos na realização destas vesículas permitindo aproximar da composição biológica das membranas das bactérias e humanas. Estes sistemas modelo de membranas podem ser usados com diferentes tamanhos, tendo sido nesta tese estudadas as interacções com vesículas lipídicas unilamelares grandes, de aproximadamente 100 nm, e também vesículas multilamelares com tamanhos compreendidos entre 1 e 100 micrometros. A ação sistémica dos antibióticos aquando da morte bacteriana é acompanhada pela libertação de certos componentes bacterianos em circulação sanguínea. Uns destes componentes são os lipopolissacáridos, que são libertados das membranas das bactérias Gram-negativas. Estas moléculas em circulação tornam-se agentes infecciosos que em baixas concentrações mantém o organismo em alerta contra patogénios, mas em concentrações elevadas originam uma produção excessiva de citocinas que podem culminar no choque séptico e daí resultando a morte. No caso de péptidos com actividade antibacteriana contra bactérias Gramnegativas é muito importante que, além da acção antibacteriana, os péptidos sejam capazes de neutralizar o efeito endotóxico do lipopolissacárido. A bactericidal/permeability increasing protein (BPI) é uma proteína homóloga da lipopolysaccharide binding protein (LBP) e que se encontra nos grânulos azurófilos dos neutrófilos. Além da sua actividade antibacteriana descrita é também conhecido o seu efeito neutralizador da ação do lipopolissacárido livre em circulação. Estas actividades estavam associadas à região amina da proteína. Desta forma foi desenvolvido um fragmento baseado nesta região, denominado rBPI21. O rBPI21 possui uma massa molecular de 21 kDa tendo actividade antibacteriana e também é capaz de se ligar ao lipopolissacárido, neutralizando a toxicidade provocada pelo mesmo. Esta tese de doutoramento está focada na interacção do rBPI21 com sistemas modelo de membranas e bactérias. Os estudos realizados ao longo deste trabalho foram essencialmente biofísicos, utilizando técnicas, como exemplo, espectroscopias dispersão de luz, de fluorescência e de força atómica. Nos Capítulos III e V desta tese de doutoramento é determinada, através da espectroscopia de fluorescência e da calorimetria de titulação isotérmica, a selectividade do rBPI21 para sistemas modelo de membranas com carga negativa conferida pelo fosfolípido fosfatidilglicerol. Estas membranas carregadas negativamente são um modelo aproximado das membranas das bactérias Gramnegativas. A preferência do rBPI21 para membranas contendo fosfatidiglicerol é seguida da formação de agregados membranares, estudada por espectroscopia de dispersão de luz, e também da fusão membranar. No entanto, a elevadas concentrações do rBPI21 ocorre a lise do sistema modelo de membrana. Estes estudos estão descritos no Capítulo IV da tese. No Capítulo V da tese mostra-se através do uso da dispersão de raios-X de pequeno ângulo que a interacção do rBPI21 com sistemas modelo de membranas é seguida da formação de sistemas multilamelares aquando da fusão membranar. Após os estudos efectuados com sistemas modelo de membranas, no Capítulo VI foi descrita a interacção do rBPI21 com bactérias, de forma a corroborar o mecanismo de acção observado nos sistemas modelo. Os estudos foram feitos com a bactéria Gram-negativa Escherichia coli e com a Gram-positiva Staphylococcus aureus. Estudos por microscopia de força atómica e espectroscopia de força mostram que o rBPI21 é capaz de causar a lise de ambas as bactérias e que a interacção do péptido com as mesmas é reduzida na presença de agregados livres de lipopolissacárido, evidenciando a afinidade do péptido para o lipopolissacárido na forma livre. Os resultados revelam para os determinantes da selectividade do rBPI21 para as membranas das bactérias, em detrimento das membranas de células humanas. Desta forma, o rBPI21 é um bom candidato para uso clínico, assim como um bom modelo para, através da sua estrutura, serem desenhados novos péptidos com maior actividade antibacteriana e reduzida toxicidade.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/41750/2007