Molecular mechanisms of adaptation and tolerance to acetic acid in the food spoilage yeast Zygosaccharomyces Bailii

Tese de mestrado. Microbiologia Aplicada. Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011O ácido acético é muito utilizado pela indústria alimentar e de bebidas como um agente antimicrobiano para prevenir o crescimento de microrganismos contaminantes alimentares, sendo essencialmente usado na preservação de produtos acídicos, como sejam os refrigerantes, pickles e molhos. Sob estas condições o crescimento bacteriano é limitado pelo que os principais contaminantes de comidas e bebidas acídicas são leveduras e fungos filamentosos que apresentam uma elevada capacidade de proliferar a baixo pH. O sucesso destas leveduras como agentes de deterioração alimentar encontra-se também em grande parte relacionado com a sua capacidade de adaptação e proliferação na presença de altas concentrações de ácidos fracos usados como conservantes alimentares, conduzindo a graves perdas económicas para a indústria alimentar e uma redução drástica das reservas de alimentos a nível mundial. Actualmente Zygosaccharomyces bailii é, sem dúvida, a levedura contaminante alimentar mais problemática para as indústrias de alimentos e bebidas, principalmente como resultado de sua resistência excepcional a ácidos fracos utilizados como conservantes. Em particular, Z. bailii é a espécie de levedura mais tolerante ao ácido acético. No entanto, os mecanismos subjacentes a esta resistência intrínseca estão ainda muito mal caracterizados. O objectivo deste trabalho foi, assim, contribuir para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes à adaptação e tolerância ao ácido acético na levedura contaminante alimentar altamente resistente Z. bailii. A alta tolerância das células de Z. bailii ao ácido acético tem sido parcialmente atribuída à sua capacidade de metabolizar o acetato na presença de glucose, um mecanismo que está bloqueado em S. cerevisiae, devido ao efeito repressor da glucose. Contudo, a existência de outros mecanismos de resistência também foi antecipada. Desde há alguns anos, o Grupo de Ciências Biológicas tem vindo a caracterizar os mecanismos moleculares subjacentes à tolerância de S. cerevisiae ao stress induzido por ácido acético. Embora S. cerevisiae represente uma ameaça menos grave para a indústria alimentar que Z. bailii (valores de concentração mínima inibitória para o ácido acético na gama dos 370-555 mM para Z. bailii comparados com 80-150 mM para S. cerevisiae), também é uma levedura contaminante relevante, constituindo um sistema experimental muito mais acessível. Além disso, espera-se que os conhecimentos adquiridos em S. cerevisiae possam orientar uma análise mais aprofundada em Z. bailii, uma levedura geneticamente muito menos acessível, até porque não se encontra disponível a sequência do seu genoma. A resposta global, a nível do proteoma, de S. cerevisiae ao stress induzido por ácido acético foi recentemente estudada pelo Grupo de Ciências Biológicas (Mira et al., resultados não publicados). Neste trabalho, uma análise equivalente de proteómica de expressão foi explorada para obter uma perspectiva da resposta global a concentrações inibitórias mas não letais de ácido acético em Z. bailii. Esta abordagem permitiu estudar o que acontece ao nível da expressão proteica em resposta à presença de ácido acético, através da comparação quantitativa essencialmente do proteoma citosólico, na presença e ausência deste composto tóxico. Em particular, a resposta de células de Z. bailii ISA 1307 cultivadas na presença de 120 mM de ácido acético, a pH 4, foi estudada usando a técnica de electroforese bidimensional (2-DE), uma metodologia com elevado poder de discriminação que permite separar misturas complexas de proteínas com base na sua carga, usando a técnica de focagem isoeléctrica (IEF), e peso molecular, usando electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Após separação, os géis foram corados com o corante fluorescente Flamingo (BioRad) e posteriormente digitalizados usando o scanner Thyphoon Trio e analisados com o software Progenesis Samespots. As proteínas de interesse foram depois identificadas por espectrometria de massa. Um mapa de referência do proteoma foi também produzido, e poderá ser posteriormente usado para identificar facilmente proteínas em cada gel 2-DE produzido usando o mesmo protocolo neste organismo. Esta abordagem permitiu obter informações valiosas sobre os mecanismos que tornam esta espécie de levedura uma das espécies mais resistentes ao ácido acético. As principais diferenças de expressão induzidas pelo ácido acético observadas encontram-se fundamentalmente relacionadas com o metabolismo celular, nomeadamente o metabolismo de carbohidratos. Em particular, foi possível registar a alteração ao longo do tempo das proteínas envolvidas no catabolismo do acetato, na presença e ausência de glucose. Estas alterações a nível do metabolismo celular estarão provavelmente relacionadas com a necessidade de obtenção de energia pelas células para contrariar os efeitos prejudiciais induzidos pelo ácido. De facto, algumas proteínas tipicamente associadas à resposta a stress foram identificadas nesta análise, nomeadamente uma superóxido dismutase e uma porina mitocondrial associadas à resposta ao stress oxidativo. Outras classes funcionais enriquecidas identificadas no nosso conjunto de dados encontram-se relacionadas com o metabolismo de aminoácidos, bem como com a tradução e glicosilação proteica. Neste trabalho, tentou-se também identificar, em Z. bailii, homólogos funcionais putativos de genes/proteínas identificadas em S. cerevisiae como sendo necessários para a resistência a ácido acético, através do “screening” de uma biblioteca genómica construída anteriormente. As principais vias de regulação subjacentes à resposta e adaptação de S. cerevisiae ao ácido acético foram elucidados nos últimos anos. Recentemente, foram identificados 650 genes de S. cerevisiae envolvidos na protecção contra o ácido acético e o papel e a caracterização do regulão do factor de regulação transcricional Haa1p na resposta a ácido acético foram também esclarecidos. Uma vez que foi demonstrado que a resposta e resistência das células de S. cerevisiae ao ácido acético depende de um sistema de sinalização controlado pelo factor de transcrição Haa1p, iniciámos este “screening” com vista a identificar um homólogo putativo do Haa1p. Além disso, embora a sequência genómica de Z. bailii não esteja disponível, a hipótese da existência nesta espécie de um sistema semelhante ao regulão Haa1p é apoiado pela identificação em Z. rouxii, uma levedura filogeneticamente próxima cujo genoma foi recentemente sequenciado, de um homólogo do Haa1p, bem como de homólogos de vários dos genes activados por este factor de transcrição durante a resposta ao stress induzido por ácido acético. Com este objectivo, procedeu-se à introdução de uma biblioteca genómica de Z. bailii, previamente construída, no mutante S. cerevisiae BY4741_ Δhaa1. Esta biblioteca genómica, com uma dimensão de inserção média de 6 kb e cobrindo o genoma mais de 20 vezes assumindo um tamanho de genoma semelhante ao de S. cerevisiae, foi já usada com sucesso pelos nossos parceiros do projecto ZygoSacAR na Universidade do Minho para isolar genes de Z. bailii. Os transformantes foram depois seleccionados pela sua tolerância ao ácido acético, e os que exibiam níveis de resistência semelhantes aos da estirpe parental e que portanto complementam o fenótipo de hiper-susceptibilidade do mutante, foram seleccionados. Uma selecção inicial foi feita através do crescimento em meio sólido, mas este método revelou-se pouco eficiente, com resultados ambíguos e difíceis de interpretar pelo que se adoptou um novo método. Este novo método, que envolveu a selecção dos transformantes em meio líquido usando placas de 96 poços, apesar de bastante mais trabalhoso revelou-se bastante mais adequado produzindo resultados mais fidedignos, não dependentes da observação pelo experimentador, e permitindo a identificação de um menor número de transformantes considerados resistentes. Desta forma, foram recuperados 92 candidatos resistentes e a inserção de ADN de um dos transformantes que apresentava maior resistência foi sequenciado. A sequência de ADN resultante, com um tamanho de aproximadamente 9,7 kb, foi analisada usando diversas ferramentas de bioinformática para tentar identificar potenciais genes que codifiquem proteínas cuja função possa explicar a supressão do fenótipo do mutante _Δhaa1. A análise realizada indicou a presença de três grelhas de leitura aberta putativas que codificam homólogos proteicos de três proteínas de Z. rouxii: uma proteína envolvida na biossíntese de riboflavina; outra proteína, que é um componente estrutural do citoesqueleto; e a última com função ainda desconhecida. Espera-se que para além do conhecimento científico resultante da investigação planeada, os resultados deste trabalho possam ser usados no desenvolvimento de estratégias mais apropriadas na conservação de alimentos baseada na adição de ácido acético, bem como na construção de estirpes industriais de levedura mais robustas.Zygosaccharomyces bailii is undoubtedly the most problematic spoilage yeast to the food and beverage industries, mainly as a result of its exceptional resistance to weak acids preservatives. In particular, Z. bailii is the most tolerant yeast species to acetic acid. However, the mechanisms behind this intrinsic resistance are very poorly characterized although the remarkable ability of Z. bailii to catabolize acetate in the presence of glucose, differently from Saccharomyces cerevisiae, was described. The aim of this work was to contribute to the elucidation of the molecular mechanisms underlying adaptation and tolerance to acetic acid in the highly acetic acid resistant food spoilage yeast Z. bailii. An expression proteomics approach, based on quantitative two-dimensional electrophoresis (2-DE), was explored to get a clear snapshot of the global response of this yeast species to inhibitory but non lethal concentrations of acetic acid. The major acetic acid-induced expression changes were found to be related with cellular metabolism, in particular, carbohydrate metabolism and energy generation but some cell stress response proteins were also found. Additionally, the identification of S. cerevisiae homologues of Haa1p of the Haa1- regulon and of other known determinants of acetic acid resistance in S. cerevisiae was also attempted based on the introduction of a Z. bailii genomic library previously constructed in S. cerevisiae BY4741_Δhaa1 mutant and selection of the transformants that rescued the hyper-susceptibility phenotype of the mutant. Using this approach 92 resistant candidates were obtained and the DNA insert of one of the transformants showing higher resistance was sequenced. The resulting DNA sequence, with a size of approximately 9.7 kb, harbored three ORFs encoding protein homologues of three Z. rouxii proteins: one protein involved in riboflavin biosynthesis; other protein, which is a structural constituent of cytoskeleton; and the last one that has a yet unknown function