Diversidade microbiana, suscetibilidade a antibióticos e fatores de virulência em Enterococcus spp.

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Durante muitos anos os enterococos foram considerados inofensivos para o homem. No entanto, atualmente são considerados patogénicos emergentes, devido à sua elevada resistência a antibióticos e produção de fatores de virulência. No presente estudo, foi avaliada a presença e a diversidade de Enterococcus spp. em amostras recolhidas numa queijaria, num matadouro de suínos e num hipermercado. Utilizando metodologias fenotípicas e moleculares, um total de 149 isolados foi obtido, a partir de amostras de alimentos, de águas e de superfícies. De seguida, para a avaliação da diversidade microbiana da coleção em estudo, foi aplicada a técnica de PCR-fingerprinting. Os perfis obtidos foram analisados utilizando o software BioNumerics e a construção de dendrogramas permitiu a seleção de 71 isolados como representantes da coleção, 38 pertencentes à espécie E. faecalis, oito E. faecium, um E. durans e um E. casseliflavus, sendo que 23 permaneceram por identificar. Para estimar o potencial de patogenicidade dos isolados em estudo, estes foram avaliados quanto ao nível de suscetibilidade a agentes antimicrobianos (19 antibióticos) e presença de fatores de virulência (adesinas, fatores secretados e feromonas sexuais). Todos os isolados mostraram-se resistentes ao trimetoprim-sulfametoxazol mas nenhum apresentou resistência à ampicilina, gentamicina, amoxicilina-ácido clavulânico, nitrofurantoína ou linezolide. Para a quinupristina-dalfopristina, tetraciclina e bacitracina as resistências verificadas foram acima dos 50% sendo que, para os restantes antibióticos, mantiveram-se abaixo desse valor. Na pesquisa de fatores de virulência, 52% dos isolados revelaram-se β-hemolíticos, embora o gene cylA não tenha sido detetado; 39% foram gelatinase positivos, sendo que 45% possuíam o gene gelE, e 32% foram considerados lipolíticos. Para os restantes genes pesquisados, detetaram-se percentagens acima dos 50% para ccf, cpd e efaAfs e abaixo dos 50% para agg, esp e efaAfm. Em conclusão, estas bactérias estão disseminadas pelos ambientes em estudo, embora em níveis reduzidos, uma vez que a maioria foi obtida após enriquecimento das amostras recolhidas. O facto de a maioria dos isolados terem sido identificados como E. faecalis (considerada a espécie mais patogénica), de 66% dos isolados serem multirresistentes e de ter sido detetada a presença de genes codificantes para adesinas, fatores secretados e feromonas sexuais, aponta para o seu potencial patogenicidade. No entanto, a sua suscetibilidade a antibióticos de importância clínica diminui o risco associado.For many years, enterococci have been considered harmless to humans. However, due to their high antibiotic resistance and virulence factors production, they are currently considered as emerging pathogens. In the present study, we evaluated the presence and diversity of Enterococcus spp. in samples collected from a cheese factory, a slaughterhouse and a supermarket. Using phenotypic and molecular methods, a total of 149 strains were obtained from samples of food, water and food-processing surfaces. Then, in order to evaluate the microbial diversity of the collection under study, PCR-fingerprinting was applied. The patterns obtained were analyzed using the BioNumerics software and the construction of dendrograms allowed the selection of 71 isolates as representatives of the collection, 38 belonging to the species E. faecalis, eight E. faecium, one E. durans and one E. casseliflavus, 23 enterococci remained unidentified. To estimate the pathogenicity potential of the isolates under evaluation, their antimicrobial susceptibility to 19 antibiotics was assessed, as well as the presence of virulence factors (adhesins, secreted factors and sex pheromones). All isolates were resistant to sulphamethoxazol/trimethoprim, but none were resistant to ampicillin, gentamicin, amoxicillin/clavulanate, nitrofurantoin or linezolid. For quinupristin-dalfopristin, tetracycline and bacitracin the resistance levels observed were above 50 %, while for the remaining antibiotics resistance was below this value. Screening for virulence factors showed that 52% of the isolates were β-hemolytic, even though the gene cylA was not detected, 39% were gelatinase positive, and 45% had the gelE gene, while 32% were lipolytic. For the remaining genes surveyed, rates above 50% were observed for the ccf, cpd e efaAfs and below 50% for agg, esp and efaAfm. Overall, we can conclude that these bacteria are disseminated among all the studied environments, thus in reduced levels, once the majority of isolates was obtained only after sample enrichment. Since most of the isolates were identified as E. faecalis (considered the most pathogenic species); 66% of the isolates were multidrug-resistant and genes coding for adhesins, secreted factors and sex pheromones were detected, their potential pathogenicity is suggested. However, due to their susceptibility to clinically important antibiotics, the associated risk is probably reduced