Splicing mutations: making sense with antisense therapy

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Galactose-1-phosphate uridylyltransferase (GALT) transfers a UMP group from UDP-glucose to Gal1P in the second step of the Leloir pathway for galactose metabolism. Pathogenic mutations in the GALT gene cause deficient or absent activity of the enzyme and result in Classical Galactosemia. Mutational analysis of 27 Portuguese patients confirmed Q188R as the prevalent molecular defect (≈60%), and revealed the intronic variation c.820+13a>g (IVS8+13a>g) as the second most frequent mutation, accounting for 12.5% of the mutant alleles. In silico analysis revealed that the presence of the c.820+13a>g variation activates a cryptic splicing donor site and seems to create a strong ESE motif for the binding of the SRSF1 protein. A minigene-based approach was used to analyze the effects of this presumptive pre-mRNA splicing mutation. The pSPL3 vector containing either the genomic wild-type or mutant fragments was transfected into COS-7 and Hek293 cell lines. 24h after transfection, RNA was purified and amplified by RT-PCR. Direct sequencing analysis of the reaction products clearly showed that c.820+13a>g favors the next GT dinucleotide (c.820+14_15) to be used as a new 5’ splice donor site, leading to the inclusion of the first 13 nucleotides of intron 8 in the coding sequence, thus inducing a frameshift which generates a premature stop codon 17 amino acids downstream (p.D274fsX291). Additionally, in vivo studies demonstrated that, contrarily to the control individuals, a homozygous patient for c.820+13a>g mutation only presented alternative transcripts with the inclusion of the first 13 nucleotides of intron 8. Accordingly, c.820+13a>g may be considered indeed a disease-causing mutation, being the first intronic variation in the GALT gene whose molecular mechanism was elucidated. In order to revert this alternative splicing, an antisense oligonucleotide approach was attempted, using a LNA (locked nucleic acid) that was cotransfected with the minigenes in COS-7 and Hek293 cells; however, this preliminary experience was not effective, so new alternatives will be developed.A galactose-1-fosfato uridililtransferase (GALT) é a enzima responsável pelo segundo passo da via de Leloir, a principal via catabólica da galactose no organismo humano. A GALT transfere um grupo UMP da UDP-glucose para a galactose-1-fosfato (Gal1P), libertando glucose-1-fosfato (Glc1P) e formando UDP-galactose. Uma ausente ou deficiente actividade de GALT é causadora de Galactosémia Clássica (GC). A GC é uma doença metabólica rara que apresenta prevalência diversa de acordo com as diferentes populações, afecta cerca de 1 em cada 47 mil nados vivos nas populações caucasianas europeias e está associada a mutações no gene GALT. O gene GALT situa-se na região 13 do braço curto do cromossoma 9, cobre cerca de 4 kb de DNA genómico e organiza-se em 11 exões. Este gene codifica uma proteína de 379 aminoácidos com uma massa molecular de 43 kDa. A enzima activa é um homodímero com uma massa molecular total de 88 kDa. Até à data, foram já descritas mais de 200 variações no gene GALT. Embora a maioria sejam mutações pontuais do tipo missense, também foram detectadas mutações nonsense, alterações silenciosas, assim como deleções e mutações de splicing. Algumas destas variações são comuns, mas a maioria são raras e desconhece-se a sua importância funcional. As mais citadas são Q188R, K285N, S135L e N314D, sendo as duas primeiras as mais frequentes na população europeia. Estudos mutacionais em 27 doentes Portugueses confirmaram que a mutação Q188R é a prevalente (≈60%), e revelaram que a variação intrónica c.820+13a>g (IVS8+13a>g) é a segunda mais frequente, estando presente em cerca de 12,5% dos alelos mutados. Nas situações em que a conversão da Gal1P em Glc1P está comprometida, ocorre uma acumulação excessiva de galactose e de Gal1P, causando toxicidade no organismo. Actualmente, o único tratamento disponível consiste na restrição dietética de galactose, o qual diminui drasticamente a mortalidade neonatal por galactosémia. A longo prazo, apesar de salvar muitas vidas, esta terapia revela-se contudo insuficiente. Portanto, o desenvolvimento de novas terapias torna-se essencial. Os objectivos do presente estudo foram a elucidação do mecanismo patogénico subjacente à mutação c.820+13a>g, a confirmação do seu efeito in vivo e, por fim, a tentativa da sua correção através de terapia com oligonucleótidos antisense. Primeiramente, procedeu-se a um estudo in silico para prever a patogenicidade da mutação. O resultado revelou que a presença desta variação parece activar um sítio críptico (c.820+14_15) dador de splicing. Contudo, ao analisar a sequência mutada, este sítio críptico não foi reconhecido pelo programa NNSPLICE, mas apresentou uma pontuação de 0,70 no programa NetGene2. Por outro lado, aquando da análise da sequência mutada, este 5’GT críptico foi reconhecido pelos dois programas mencionados, apresentando uma pontuação de 0,95 e 0,93, respectivamente. Estas pontuações revelaram-se superiores às obtidas pelo sítio de splicing natural, o qual foi pontuado, na sequência mutada, com apenas 0,64 e 0,82 pelos programas NNSPLICE e NetGene2, respectivamente. Adicionalmente, na sequência mutada verificou-se o fortalecimento do motivo ESE (exonic splicing enhancer) para a ligação do factor de splicing SRSF1 (CCCAGGT, posições 9-15 do intrão 8). Com efeito, o ESE contendo o nucleótido mutado revelou uma pontuação de 3,906278 enquanto que a presença do nucleótido normal conferia apenas a pontuação de 1,986666, valor muito próximo do limiar do programa (1,956). Para a caracterização do mecanismo molecular subjacente a esta potencial mutação de splicing, recorreu-se à utilização da tecnologia dos minigenes. Para tal, os fragmentos genómicos de interesse, correspondentes à sequência génica normal e mutada do gene GALT, foram clonados no vector de splicing pSPL3 e designados pSPL3.wt e pSPL3.mut, respectivamente. De seguida, procedeu-se à sua transfeção em duas linhas celulares eucariotas, COS-7 e Hek293. 24 horas após transfeção, extraiu-se o RNA total celular que foi utilizado para amplificação por RT-PCR das sequências transcritas in vitro. A análise em gel de agarose do perfil transcricional das duas linhas celulares demonstrou a existência de splicings alternativos, quer nas células transfectadas com o pSPL3.wt quer com o pSPL3.mut. A sequenciação de alguns destes fragmentos revelou que, tal como previsto in silico, a mutação favorece a utilização do 5’GT críptico que se localiza nos nucleótidos imediatamente a seguir, causando um splicing alternativo. Em ambas as linhas celulares transfectadas com pSPL3.mut, mas não nas transfectadas com pSPL3.wt, ocorre a inclusão dos primeiros 13 nucleótidos do intrão 8 nos transcritos. Esta inclusão na sequência codificante leva à mudança do quadro de leitura e à criação de um codão stop prematuro 18 aminoácidos a jusante (D274fsX291). Paralelamente, estudos in vivo desmonstraram que, contrariamente ao esperado, os transcritos alternativos contendo um codão stop prematuro não sofreram NMD (nonsense mediated decay). De facto, a análise dos transcritos de um doente homozigótico para a mutação c.820+13a>g revelou, tal como nos indivíduos controlo, a presença de dois transcritos. Nos indivíduos controlo, o fragmento maior com 378pb corresponde a uma reação de splicing em que são utilizados os sítios naturais de splicing e, como tal, inclui o fim do exão 7, exão 8, exão 9 e início do exão 10; o fragmento menor com 294pb corresponde a um evento de splicing alternativo que leva à não inclusão do exão 9 na sequência final do mRNA. A análise do doente revelou o mesmo padrão de transcrição, diferindo os fragmentos observados na presença adicional dos 13 primeiros nucleótidos do intrão 8. Tendo em conta os resultados obtidos, foi possível concluir que o splicing alternativo do exão 9 não é causado pela mutação c.820+13a>g, uma vez que também ocorre nos indivíduos controlo. Desta forma, confirmou-se que a mutação c.820+13a>g (IVS8+13a>g) é de facto causadora de doença, sendo a primeira variação intrónica no gene GALT cujo mecanismo molecular foi elucidado. De seguida, e com o intuito de reverter o splicing alternativo causado pela mutação, procedeu-se a uma tentativa da sua correção utilizando oligonucleótidos antisense. Para tal, e tendo em conta a proximidade da mutação ao sítio de splicing natural, selecionou-se a utilização de um LNA (locked nuclei acid). Após cotransfeção dos minigenes e do IVS8-LNA nas linhas celulares COS-7 e Hek293, isolou-se o RNA total celular e procedeu-se à respectiva amplificação por RT-PCR. Os padrões de splicing alternativo observados em ambas as linhas celulares foram semelhantes, quer em células não-tratadas, quer em células tratadas. Adicionalmente, a sequenciação de alguns dos fragmentos obtidos revelou a presença dos 13 primeiros nucleótidos do intrão 8 tanto nas células transfectadas com pSPL3.mut como nas células cotransfectadas com pSPL3.mut e IVS8-LNA. Assim, esta experiência preliminar revelou que o tratamento não foi eficaz na correção do splicing alternativo, realçando a necessidade de melhorar a presente metodologia ou de procurar outras alternativas terapêuticas