Adaptive strategies of Burkholderia cenocepacia to long term residence in the lungs of cystic fibrosis patients

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012 [Versão pública]O complexo de bactérias Burkholderia cepacia (Bcc) é um grupo heterogéneo com pelo menos 17 espécies relacionadas que podem causar infeções respiratórias graves em indivíduos imunocomprometidos. Doentes com SIDA ou cancro sob quimioterapia correm um risco elevado de infeção com bactérias do Bcc, bem como doentes com fibrose quística (FQ), a doença autossómica recessiva letal mais comum na raça caucasiana, com uma prevalência na Europa de cerca de 0,737 pacientes por 10 000. A FQ é caracterizada pela ausência de um transportador de cloreto funcional normalmente expresso em membranas epiteliais, levando à insuficiência sistémica de vários órgãos e à predisposição para infeções respiratórias crónicas recorrentes com diversas espécies bacterianas. Estas infeções contribuem significativamente para obstrução pulmonar progressiva, lesões extensas dos tecidos e morte prematura, sendo uma ameaça clínica séria. As bactérias do Bcc são agentes patogénicos oportunistas praticamente impossíveis de erradicar do pulmão com FQ. Um dos principais problemas associados à infeção com bactérias do Bcc é a sua resistência intrínseca a vários antibióticos e péptidos antimicrobianos do sistema imune, assim como a sua capacidade de formar biofilmes e produzir diversos fatores de virulência durante a interação com o hospedeiro. Embora Pseudomonas aeruginosa seja o patogénico oportunista mais prevalente em doentes com FQ, as infeções respiratórias crónicas com bactérias do Bcc conduzem geralmente a um declínio mais rápido da função pulmonar e, em aproximadamente 30% dos casos, à síndrome da cepacia, uma pneumonia fatal necrotizante. No decorrer de uma infeção crónica pulmonar associada à FQ, os microrganismos patogénicos evoluem em resposta a pressões seletivas exercidas pelo ambiente existente nas vias respiratórias do hospedeiro, em particular aquelas que resultam de desafios do sistema imune, da terapia antimicrobiana administrada, da disponibilidade de nutrientes e da limitação de oxigénio. Esta adaptação leva ao aparecimento de variantes fenotípicos a partir da população inicial que se estabelecem por adaptação genética e exibem diferentes padrões de suscetibilidade a antibióticos e outras diferenças importantes no âmbito da infeção crónica. Revelar a base molecular dos mecanismos relacionados com a adaptação, patogenicidade e virulência das bactérias do Bcc é de extrema importância e poderá ajudar a delinear novas estratégias para combater infeções causadas por estas bactérias. O grupo BSRG-IBB/IST tem mantido nas últimas 2 décadas uma colaboração ativa com o maior centro nacional de tratamento de FQ, o Serviço de Patologia Clínica do Hospital de Santa Maria (HSM), em Lisboa. Nos últimos 16 anos foi realizado o estudo epidemiológico de bactérias do Bcc envolvidas em infeções respiratórias neste Centro. Foram publicados os primeiros estudos que descrevem a epidemiologia das bactérias do Bcc em doentes com FQ em Portugal e foi reunida uma coleção com mais de 500 isolados clínicos. Esta coleção foi obtida a partir dos isolados recolhidos da expetoração de diversos doentes com FQ desde 1995 e inclui isolados clínicos, vários deles variantes clonais recolhidos no decorrer da infeção provocada pelas bactérias do Bcc em pacientes persistentemente colonizados. Este estudo sistemático e longitudinal, incluindo 41 doentes infetados cronicamente com bactérias do Bcc, representa um caso de estudo e uma oportunidade única para compreender a adaptação destes microrganismos patogénicos no interior do pulmão com FQ. As espécies mais prevalentes entre a população acompanhada neste centro de FQ são Burkholderia cepacia e Burkholderia cenocepacia, uma exceção em relação ao observado mundialmente, onde B. cenocepacia e Burkholderia multivorans são as espécies predominantes. A investigação conduzida nos últimos anos inclui abordagens ÓMICAS que têm sido levadas a cabo pelo grupo com o intuito de revelar os mecanismos moleculares envolvidos na adaptação das bactérias do Bcc ao pulmão com FQ, numa perspetiva de biologia de sistemas. Em particular, o proteoma intracelular e associado à superfície e o transcriptoma de 3 isolados sequenciais recolhidos do mesmo paciente (paciente J) foram recentemente analisados. Este paciente esteve colonizado com a mesma estirpe durante 3 anos e meio até à sua morte, provocada pela síndrome da cepacia. Durante este período, 11 isolados sequenciais foram recolhidos das secreções respiratórias deste paciente, como parte de uma rotina hospitalar. Os 3 isolados mais estudados incluem o IST439, o primeiro isolado a ser recolhido e aquele que se pensa ser responsável pelo início da infeção; o IST4113, um isolado recolhido quase 3 anos mais tarde e após um período de infeção exacerbada e de terapia intravenosa; e o IST4134, o último isolado a ser recolhido deste paciente antes da sua morte com a síndrome da cepacia. As análises de expressão genética ao nível do genoma, baseadas em proteómica quantitativa de extratos celulares (endoproteoma) e transcriptómica aplicada a estes isolados identificaram 79 proteínas e mais de 1 000 genes diferencialmente expressos, indicando uma adaptação genética dos isolados às condições presentes no pulmão com FQ. Os resultados obtidos foram considerados promissores, pelo que o presente trabalho pretende continuar este estudo, agora com o objetivo de analisar o exoproteoma destes 3 isolados e identificar proteínas exportadas envolvidas na virulência destes isolados e que deverão ter um papel importante na interação microrganismo-hospedeiro. Assim, o presente estudo apresenta uma inovação em relação aos trabalhos anteriores, pois teve como objetivo apreciar a alteração do conteúdo de proteínas presentes no exoproteoma. Para isso, o crescimento das células teve que ser realizado em meio líquido e sem agitação, o que se pensa permitir uma diminuição gradual do oxigénio disponível no meio, tal como se pensa acontecer no pulmão com FQ durante a infeção bacteriana. Deste modo, tanto o crescimento das células nestas condições como o próprio protocolo de concentração do sobrenadante foram cuidadosamente otimizados. Neste trabalho foi feita uma análise comparativa do exoproteoma dos três isolados clínicos IST439, IST4113 e IST4134 usando uma abordagem de proteómica de expressão baseada na técnica de electroforese bidimensional (2-DE), uma metodologia com elevado poder de discriminação que permite separar misturas complexas de proteínas com base na sua carga e peso molecular. Após separação, os géis foram corados com o corante fluorescente Flamingo (BioRad) e posteriormente digitalizados usando o scanner Thyphoon Trio e analisados com o software Progenesis Samespots®. As proteínas de interesse foram depois identificadas por espectrometria de massa. Esta abordagem revelou a presença de várias proteínas extracelulares que são diferentemente abundantes nos três isolados e que poderão estar envolvidas na adaptação e virulência destes isolados no microambiente do pulmão com FQ, incluindo uma metaloprotease de zinco, proteínas envolvidas nos sistemas de secreção de tipo IV e VI, proteínas envolvidas na alteração da estrutura do lipopolissacárido e na síntese de peptidoglicano, e ainda um fator de virulência pouco conhecido mas que também tem sido identificado noutras espécies de bactérias do Bcc (AidA). Foram ainda identificadas outras proteínas extracelulares e membranares que, não estando diretamente relacionadas com a virulência destes isolados, contribuem para a sua adaptação ao microambiente do pulmão com FQ, como por exemplo uma permease de purinas, proteínas envolvidas na importação de iões inorgânicos, proteínas envolvidas na importação do grupo heme e diferentes subunidades de vários transportadores do tipo ABC. Para além destas, foram também identificadas proteínas cuja função é ainda pouco conhecida ou totalmente desconhecida e proteínas com funções citoplásmicas e das quais não há informação de que sejam exportadas. Contudo, para algumas destas proteínas já foram identificadas funções extracelulares, para além das suas funções citoplasmáticas conhecidas, e por isso têm sido referidas como proteínas moonlighting. Várias destas proteínas já foram também identificadas em diversos estudos de exoproteomas tanto em bactérias do Bcc, como noutras bactérias patogénicas. Assim, para além de contribuírem para o atual conhecimento das estratégias de adaptação e invasão de B. cenocepacia durante a infeção do pulmão com FQ, estes resultados podem abrir portas a novas investigações para determinar o papel de determinadas proteínas identificadas que poderão ser relevantes no contexto da infeção, mas cuja função específica não é ainda totalmente conhecida. Dado que várias destas proteínas são reguladas por mecanismos de Quorum Sensing (QS), os níveis de N-acilhomoserina lactonas, as moléculas sinalizadoras destes sistemas de regulação, foram também comparados entre os três isolados. Neste trabalho tentou-se ainda identificar genes envolvidos na adaptação a condições de microaerofilia, através do rastreio de uma biblioteca de mutantes construída na estirpe B. cenocepacia J2315 por inserção do transposão mini-Tn5 Tel. Esta biblioteca é constituída por cerca de 7 500 clones e foi construída pelo parceiro de investigação Bio-Iliberis R&D, no contexto do projeto “EraNet Pathogenomics ADHRES Signature Project” (ERA-PTG/SAU/0001/2008). O estudo foi levado a cabo em condições de aerofilia e microaerofilia, de forma a identificar os clones capazes de crescer em aerofilia, mas incapazes de crescer em microaerofilia, uma vez que estes seriam os clones em que o transposão ter-se-ia inserido num gene relevante para a adaptação à microaerofilia. Neste estudo apenas foram considerados fenótipos de total ausência de crescimento em microaerofilia e cada fenótipo foi confirmado duas vezes nas mesmas condições. Dos cerca de 7 500 clones que constituem esta coleção, 480 exibiram crescimento em aerofilia e ausência de crescimento em microaerofilia, mas apenas num clone foi possível confirmar o fenótipo duas vezes. Deste modo, durante o rastreio foi observada uma grande instabilidade genética por parte dos clones e é sugerido que parte dos clones que constituem a biblioteca possam ter perdido o transposão e adquirido resistência à telurite, a marca de seleção usada. Assim, a abordagem implementada não foi eficaz na identificação de genes envolvidos na adaptação metabólica necessária na transição de crescimento em aerofilia para microaerofilia.Respiratory infections with Burkholderia cepacia complex (Bcc) bacteria are particularly threatening in cystic fibrosis (CF), where pulmonary colonization with Bcc is largely associated with worse prognosis. Acquisition of Bcc typically results in chronic infection for years by one or a few lineages. These bacterial populations adapt to the anatomically deteriorating lung environment, immune defences and antibiotic therapy. The aim of this work was to contribute to the elucidation of the mechanisms underlying Burkholderia cenocepacia adaptation to the CF lung. An expression proteomic approach based on two-dimensional electrophoresis (2-DE) was explored to compare the exoproteomes of three sequential B. cenocepacia clinical isolates retrieved from the same patient, who was chronically colonized with the same strain during 3.5 years, until death caused by the cepacia syndrome. As this was the first time that the exoproteome of these isolates was assessed, growth conditions and the exoproteome collection protocol were carefully optimized. The identified proteins as sharing different content in the three clinical isolates include several virulence factors, such as the extracellular zinc metalloprotease ZmpA, type IV and VI secretion systems proteins, proteins involved in the alteration of LPS structure and peptidoglycan biosynthesis and the virulence factor AidA. Moreover, other extracellular and membrane-associated proteins not directly involved in virulence were also identified, including a putative purine permease, proteins involved in inorganic ion uptake, proteins involved in haem uptake, and different subunits of several ATP-binding cassette transport systems. In addition, several cytoplasmic proteins with putative moonlight roles in the extracellular milieu have also been identified. These results might reveal potential biological targets for effective antimicrobial therapy under conditions close to those found in the CF lung. Given that several of the identified proteins are regulated by quorum sensing (QS) mechanisms, the levels of N-acylhomoserine lactones were also compared among these isolates. To further investigate the mechanisms underlying B. cenocepacia adaptation to microaerophilic conditions, a B. cenocepacia J2315 mini-Tn5 transposon mutant library was screened both in aerophilic and microaerophilic conditions. However, this methodology failed to identify genes involved in metabolic adaptation to microaerophily