Tetracycline tagging in embryos of two gobiesocid species, L. purpurea and L. lepadogaster

Tese de mestrado. Biologia (Ecologia Marinha). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012For the past few years studies of larval dispersal have been gaining notoriety, partially due to the innovating technologies that facilitate these kinds of works. Larval dispersal is crucial in the understanding of population dynamics and connectivity, which have important implications in the design and maintenance of Marine Protected Areas (MPAs). The marking of calcified tissues with the antibiotic tetracycline is a frequently used methodology in scientific studies, and in the past decades it has been used to study population connectivity through larval dispersal. The main goal of this work was to validate the procedure for tetracycline tagging of the otoliths of embryos of two gobiesocid species found in the Portuguese coast: Lepadogaster purpurea and Lepadogaster lepadogaster. This meant determining what would be the minimum tetracycline concentration needed to mark the larvae’s otoliths with an immersion time of only 30 minutes, and to assess if these immersions had any effect on the larvae’s survival rates. For this purpose, eggs, in the pigmented-eye stage, were immersed for 30 minutes in different concentrated tetracycline solutions, in order to determine the appropriate concentration for successful marking of otoliths. In addition, the possible effects of tetracycline in larvae’s survival rates were also analyzed. Observation of otoliths of larvae of different ages, under a fluorescence microscope, showed a high percentage of autofluorescence, both in control and treatment samples, with no otoliths being considered as truly marked. Comparison of results from 30-minutes immersions and longer ones indicate that for this tagging technique, the immersion time also plays a key role, having the 2 and 15-hours immersions produced positively- tagged otoliths. However, after statistical analysis, no correlation between the different tetracycline treatments and the levels of mortality was found, indicating that this immersion in tetracycline solutions for a time period of 30 minutes had no effect on the larvae’s survival rates.Recentemente, cada vez mais atenção tem sido dada à problemática da perda da biodiversidade dos ambientes marinhos, assim como da depleção dos stocks de pesca. Uma solução encontrada é a criação de Zonas Marinhas Protegidas (ZMP). Porém, para uma correcta criação e manutenção destas zonas, é necessário um profundo conhecimento da dinâmica existente entre as populações locais. A conectividade entre populações é geralmente definida como a ligação demográfica existente entre populações através da dispersão de indivíduos sob a forma larvar. O nível de conectividade entre populações determina se estas serão consideradas como demograficamente “abertas” ou “fechadas”. A maioria dos organismos marinhos possui um ciclo de vida bipartido, constituído por uma fase dispersiva, normalmente sob forma larvar pelágica, e uma fase bentónica, que geralmente se refere à fase adulta da vida do indivíduo. A fase dispersiva desempenha um papel fulcral na conectividade entre populações, sendo que a grande maioria da dispersão se dá nesta fase de vida. Assim sendo, é muito importante para uma correcta construção e manutenção das ZMP um bom conhecimento das ligações existentes entre as populações locais através da dispersão larvar. Tradicionalmente, as larvas de organismos marinhos eram consideradas como partículas passivas, não tendo qualquer papel activo sobre a sua dispersão, sendo que esta era maioritariamente ditada pelo seu Período Larvar Pelágico e pelas correntes oceânicas superficiais. Assim sendo, os estudos de dispersão larvar eram bastante mais simples, bastando uma análise dos padrões das correntes oceânicas superficiais para se ter uma ideia da conectividade entre populações. Porém, avanços recentes nos estudos de genética e comportamento larvar revelam que as populações não são tão demograficamente abertas como era de esperar se as larvas tivessem um papel completamente passivo na sua dispersão. Estes estudos permitiram concluir que as larvas desenvolvem capacidades que lhes permitem escolher a sua direcção, contrariar as correntes locais, e selecionar um habitat para assentar, tendo assim um papel activo na sua distribuição. Por conseguinte, os estudos de dispersão larvar assumem uma complexidade que anteriormente não tinham. Com o objectivo de estudar a conectividade entre as populações através da dispersão larvar, inúmeras metodologias de marcação foram desenvolvidas. Estas técnicas de marcação podem envolver marcas naturais ou artificiais. De entre as marcas naturais podem contar-se as marcas genéticas, que contam com a heterogeneidade genética naturalmente presente nas populações selvagens, ou as marcas geoquímicas, cuja identificação se baseia nas assinaturas isotópicas deixadas nos tecidos calcificados dos indivíduos pelas características fisico-químicas das diversas massas de água que atravessam durante a sua vida. Já as marcas artificias, mais amplamente aplicadas, podem utilizar variados compostos químicos, desde os compostos fluorescentes, que serão utilizados neste trabalho, aos isótopos radioactivos estáveis que são transmitidos às larvas por via materna. Este estudo fez uso do composto químico tetraciclina. Este composto químico pode ser administrado de várias formas aos indivíduos marcados. No presente trabalho que consistiu na marcação de ovos de peixe, o método de marcação escolhido foi a imersão das posturas em soluções com diferentes concentrações de tetraciclina. Este composto deposita-se nos tecidos calcificados dos indivíduos, como os otólitos, os quais são depois visualizados sob uma luz fluorescente, onde assumem o aspecto de um anel brilhante. A metodologia de imersão difere de estudo para estudo, sendo mais frequente uma imersão mais prolongada numa solução de tetraciclina com uma concentração reduzida. O principal objectivo deste trabalho consistiu no desenvolvimento de uma metodologia de marcação dos otólitos das larvas destas espécies através da imersão numa solução de tetraciclina. Uma vez que esta metodologia tem como objectivo ser aplicada directamente no campo, na zona de entre-marés, durante a maré baixa, o tempo de imersão ideal seria de 30 minutos. Neste sentido, foram testadas imersões de 30 minutos em soluções com várias concentrações de tetraciclina, de maneira a determinar qual a concentração mínima necessária para efectivamente marcar os otólitos das larvas. Paralelamente, o efeito da concentração de tetraciclina na mortalidade das larvas foi avaliado. Este trabalho teve como objecto de estudo duas espécies de Gobiesocidae frequentemente encontradas na costa Portuguesa: Lepadogaster purpurea (Bonaterre, 1788) e Lepadogaster lepadogaster (Bonaterre, 1788). Estas espécies são morfologicamente muito semelhantes, diferindo apenas nas épocas reprodutivas (L. purpurea reproduz-se durante o Inverno e L. lepadogaster durante a Primavera). Possuem uma distribuição que vai desde a costa sul da Escócia, no Mediterrâneo até ao Senegal. A ecologia destas espécies está muito parcamente estudada, provavelmente devido ao seu pequeno tamanho e ao seu habitat críptico, por baixo de rochas em praias de seixos rolados. As recolhas de ovos e adultos de L. purpurea (recolhas de Janeiro a Março) e L. lepadogaster (de Março a Junho) foram realizadas na praia de Alpertuche, localizada no Parque Marinho Luiz Saldanha, na Arrábida. Após recolha, os ovos e adultos foram levados para as instalações laboratoriais no Instituto Superior de Psicologia Aplicada (ISPA) em Lisboa, onde foram mantidos em aquários. Após o estudo concluido, todos os adultos e juvenis sobreviventes foram libertados no local de recolha. As posturas foram imersas em tetraciclina quando os ovos atingiram um estado de desenvolvimento em que era já possível reconhecer os olhos dos embriões pigmentados, pois é nesta fase que os otólitos iniciam a sua formação. Para L. purpurea foram realizadas imersões de 30 minutos em soluções com as seguintes concentrações: 400 mg.L-1; 600 mg.L-1; 800 mg.L-1; 1000 mg.L-1 e 1400 mg.L-1. Adicionalmente, várias larvas recém-eclodidas foram imersas em soluções de tetraciclina com 1000 mg.L-1 durante 1, 2 e 15 horas para efeitos de controlo positivo, e desta forma avaliar visualmente a marca de fluorescência. No caso de L. lepadogaster foram realizadas imersões de 30 minutos com as seguintes concentrações: 600 mg.L-1; 800 mg.L-1 e 1000 mg.L-1. Para ambas as espécies, várias posturas foram deixadas sem tratamento a fim de servirem como grupos controlo. Após marcação, as posturas foram colocadas em aquários separados, onde eclodiram e as larvas foram desenvolvidas. As larvas foram sacrificadas em diferentes estados de desenvolvimento, e conservadas em etanol a 96% a fim de posteriormente se extraírem os otólitos para observação ao microscópio. Diariamente o número de larvas vivas em cada tratamento e cada replicado foram contabilizadas, para avaliação de taxas de mortalidade. Depois da extracção, os otólitos foram montados em lâminas e observados num microscópio de fluorescência. Os otólitos do controlo positivo foram observados, de maneira a que uma caracterização da marca fluorescente pudesse ser realizada a fim de ser comparada com os resultados das outras observações. Após observação e dependendo do aspecto da sua marca fluorescente, os otólitos foram classificados em três categorias diferentes: 0 (“Sem fluorescência”), 1/0 (“Marca não nítida” ou “Com Autofluorescência”) e 1 (“Marca Nítida”). O tratamento com maior percentagem de otólitos classificados como 1 seria considerado o tratamento óptimo. Em termos de eficiência de marcação dos otólitos, as imersões de 30 minutos revelaram-se infrutíferas, não tendo nenhum otólito ficado marcado, independentemente da espécie e da concentração aplicada. Porém, quando se comparou os resultados das imersões de tempos diferentes em soluções com 1000 mg.L-1, observou-se um melhoramento da qualidade da marca fluorescente com o aumento do tempo de imersão. Ou seja, pode-se concluir que, para estas espécies, o sucesso de uma marcação de otólitos de larvas através da imersão de posturas em soluções de tetraciclina não depende só da concentração da solução, mas também do tempo de exposição. Porém, não foi encontrada nenhuma relação estatisticamente significativa entre as imersões de 30 minutos e as diferentes taxas de mortalidade dos respectivos grupos. Assim sendo, pôde-se concluir que imersões de 30 minutos em soluções de tetraciclina até 1400 mg.L-1 não afectam as taxas de mortalidade de L. purpurea, e imersões de 30 minutos em soluções com concentrações até 1000 mg.L-1 não têm efeito sobre as taxas de mortalidade de L. lepadogaster. Os resultados sugerem, desta forma, que imersões de apenas 30 minutos não marcaram os otólitos de larvas de L. purpurea nem de L. lepadogaster. Para o sucesso da marcação serão necessários tempos de imersão mais prolongados. Estudos futuros que testem diferentes métodos de marcação de larvas deverão ser levados a cabo