Efeitos adversos de contaminantes estuarinos em células humanas: avaliação da genotoxicidade e desregulação endócrina

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012O Estuário do Sado é um ecossistema de elevado valor ecológico e económico, devido às várias atividades de pesca que suporta. Contudo, esses valores estão ameaçados pela contaminação dos sedimentos e da água do estuário por compostos com um reconhecido potencial mutagénico e carcinogénico. Este trabalho pretendeu contribuir para a avaliação do risco para a saúde humana decorrente da contaminação do Estuário do Sado, através da caracterização do potencial citotóxico e genotóxico de extratos fracionados obtidos a partir de amostras de sedimentos. Para além disso, pretendeu-se implementar um ensaio de avaliação das propriedades de desregulação endócrina das mesmas amostras. Os sedimentos recolhidos em três locais de pesca do Estuário do Sado (A, C e P) foram fracionados com solventes de diferentes polaridades: n-hexano (fração 2), diclorometano (fração 3) e metanol (fração 4). Tentou implementar-se o ensaio E-screen em células MCF-7, utilizando-se o 17-β-estradiol e o Bisfenol A, como controlo positivo. A caracterização da citotoxicidade e da genotoxicidade foi realizada em células HepG2, recorrendo-se, respetivamente, ao ensaio do vermelho neutro e ao ensaio cometa. As células MCF-7 foram expostas durante um período de 5 dias a várias concentrações dos controlos positivos, de modo, a se medir a proliferação celular. Não se conseguiu no entanto obter nos diferentes ensaios realizados uma reprodutibilidade do método. No ensaio do vermelho neutro foi observada uma diminuição da viabilidade celular principalmente nas frações A4, P3 e P4 o que sugere a existência de contaminantes nestas frações com capacidade de induzir citotoxicidade. No que diz respeito aos efeitos ao nível do ADN, observou-se uma elevação significativa do nível de lesões no ADN apenas nas frações 2 e 4 da amostra P. As diferenças registadas nos efeitos citotóxicos e genotóxicos entre as frações e as várias amostras sugerem que existem diferentes contaminantes nestas amostras, e além disso que diferentes contaminantes são extraídos com cada um dos compostos usados na preparação das diferentes frações. Estes resultados refletem as diferentes pressões exercidas ao longo do Estuário do Sado, e salientam a importância de estabelecer associações entre a identificação e quantificação dos contaminantes presentes nas amostras com os seus efeitos biológicos de modo a tentar tirar ilações sobre um potencial impacto na saúde humana.The Sado Estuary is an ecosystem of high ecological and economic value, due to the fishing activities performed by the local population. Nevertheless, these values are threatened by the contamination of the estuary’s sediments and waters, by compounds with a recognized mutagenic and carcinogenic potential. This study aims to contribute to the evaluation of the potential risk to the human health, associated with the Sado Estuary’s contamination, through the characterization of the cytotoxic and genotoxic potential of fractionated extracts obtained from sediment samples. Furthermore, it was intended to implement an assay to evaluate the endocrine disrupting properties of the same samples. The collected samples from 3 fishing sites of the Sado Estuary (A, C and P) were fractionated with solvents of different polarities: n-hexane (fraction 2), dichloromethane (fraction 3) and methanol (fraction 4). The implementation of the E-screen assay in MCF-7, using 17-β-estradiol and Bisphenol A, as positive controls was attempted. The characterization of cytotoxicity and genotoxicity was performed in HepG2 cells by the Neutral Red and Comet assays, respectively. MCF-7 cells were exposed for 5 days to differences concentrations of the positive controls, in order to measure cellular proliferation. The method reproducibility was not achieved in the different assays performed. In the Neutral Red assay, a decrease in cell viability was observed, mainly for fractions A4, P3 and P4, which suggests the existence of contaminants in these fractions, with the ability to induce cytotoxicity. Regarding the effects at the DNA level, a significant increase in the level of DNA damage was observed for fractions 2 and 4 of sample P. The observed difference in cytotoxic and genotoxic effects, between fractions and samples, suggests the existence of different contaminants in these samples, and, furthermore, that different contaminants are extracted with each solvent used in the extraction process. These results reflect the different anthropogenic pressures along the Sado Estuary’s margins, and emphasize the importance of establishing associations between the identification and quantification of contaminants in sediments and their biological effects, in order to assess the potential impact of the human health