Crossroads of homocysteine, nitric oxide and asymmetric dimethylarginine metabolisms:involvement of S-adenosylhomocysteine and impaired cellular methylation

Tese de doutoramento, Farmácia (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012Elevated homocysteine, or hyperhomocysteinemia, is an independent risk factor for vascular disease. However, the precise mechanisms underlying this association, although intensively studied, are still incompletely solved. The precursor of all homocysteine produced in the body is S-adenosylhomocysteine (AdoHcy), a strong methyltransferase inhibitor. When homocysteine accumulates, AdoHcy accumulates as well, potentially disturbing most of the transmethylation processes within the cell. Notably, the role of AdoHcy has gained increased attention, regarding the pathophysiology of hyperhomocysteinemia. In fact, in recent studies, not homocysteine, but rather AdoHcy emerged as a more insightful indicator of vascular disease and tissue damage. Thus, in the present work, we postulate that elevated homocysteine itself may not be the major causative factor for the development of vascular disease, and sought to investigate whether AdoHcy accumulation, by disturbing cellular transmethylation reactions, would influence vascular homeostasis. Specifically, we will focus on the endothelium production of nitric oxide (NO), a potent anti-atherogenic molecule, and on the metabolism of asymmetric dimethylarginine (ADMA), an endogenous inhibitor of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Chapter 1 comprises a general introduction on homocysteine metabolism, including a review of the major concepts concerning regulation, determinants of hyperhomocysteinemia and proposed pathophysiological vascular mechanisms, with special interest on the NO/ADMA pathways. Chapter 2 presents the aims and outline of this thesis. We first investigated the impact of an impaired methylation environment due to AdoHcy accumulation on NO bioavailability. For that, we cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with adenosine-2,3-dialdehyde (ADA), a well-known inhibitor of the enzyme that reversibly converts AdoHcy in homocysteine, to elevate the intracellular levels of AdoHcy (but not of homocysteine), thus establishing our work model characterized by cellular hypomethylation. We observed a decreased NO production due to lower protein levels and activity of the enzyme eNOS, but yet up-regulated levels of the correspondent mRNA. Taken together, these data suggest that eNOS expression is target of post-translational mechanisms possibly involving methylation steps, hence influenced by AdoHcy (Chapter 3). Since the analysis of global DNA methylation was a central point in this work, we compared two most frequently used methods for measuring global DNA methylation, available in our laboratory: a traditional assay using methylation-sensitive enzyme digestion, and other involving DNA acid hydrolysis. Data confirmed that both methods are feasible tools for DNA methylation studies, but the latter approach presented considerable advantages, not only by allowing an absolute quantification, but also because displayed lower intraday variability (Chapter 4). The next objective was to evaluate the effect of AdoHcy and impaired cellular hypomethylation on ADMA metabolism, namely upon its metabolic degradation by the enzyme dimethylarginine dimethylaminehydrolase (DDAH) (Chapter 5). HUVEC were cultured with ADA or 5-aza-2-deoxycitidine (AZA), which targets DNA methyltransferases and specifically inhibits DNA methylation without accumulation of AdoHcy. Although both compounds induced global DNA hypomethylation, our data showed that only ADA (not AZA) increased DDAH activity, suggesting that AdoHcy stimulates the activity of DDAH by a mechanism independent of DNA methylation. In Chapter 6 we aimed to determine the extent to which protein arginine methylation studies, but the latter approach presented considerable advantages, not only by allowing an absolute quantification, but also because displayed lower intraday variability (Chapter 4). The next objective was to evaluate the effect of AdoHcy and impaired cellular hypomethylation on ADMA metabolism, namely upon its metabolic degradation by the enzyme dimethylarginine dimethylaminehydrolase (DDAH) (Chapter 5). HUVEC were cultured with ADA or 5-aza-2-deoxycitidine (AZA), which targets DNA methyltransferases and specifically inhibits DNA methylation without accumulation of AdoHcy. Although both compounds induced global DNA hypomethylation, our data showed that only ADA (not AZA) increased DDAH activity, suggesting that AdoHcy stimulates the activity of DDAH by a mechanism independent of DNA methylation. In Chapter 6 we aimed to determine the extent to which protein arginine methylation status is affected by accumulation of AdoHcy. For that, protein-incorporated ADMA levels were quantified in our cell model. Interestingly, the data indicated that protein methylation is more sensitive to AdoHcy accumulation than DNA methylation, pinpointing a possible new player in homocysteine-related diseases. In fact, protein methylation is emerging as crucial to cellular homeostasis, and its dysregulation may lead to disease. In Chapter 7, using a diet-induced hyperhomocysteinemia rat model, we investigated the in vivo effect of chronic hyperhomocysteinemia on tissue global DNA methylation. We verified that diets capable of inducing hyperhomocysteinemia also disturb cellular methylation potential in liver and heart, but only severely elevated AdoHcy levels affect global DNA methylation, and in a tissue-specific manner. Increased levels of ADMA have been suggested to contribute for the homocysteine-induced vascular toxicity. CBS (cystathionine β-synthase) deficiency, or Classical Homocystinuria, is an inherited disorder of homocysteine metabolism that results in abnormally elevated levels of homocysteine in the blood, and serious complications in the cardiovascular system. In Chapter 8 we present our study showing that severe hyperhomocysteinemia is not associated with increased ADMA plasma levels in CBS deficient patients, supporting the possibility that intracellular accumulation of AdoHcy, as result of high homocysteine levels, impairs protein methylation processes, thereby the synthesis of ADMA. Lastly, Chapter 9 presents a general discussion, major conclusions and future perspectives disclosed by this thesis. In summary, the work here described provides evidence to what extent a disturbed cellular methylation due to elevated AdoHcy may contribute to the pathophysiology of homocysteine.A doença vascular é a principal causa de morbilidade e de mortalidade no mundo ocidental industrializado. Ao longo das últimas décadas, níveis elevados de homocisteína, ou hiper-homocisteinémia (HHcy), têm sido considerados um factor de risco independente para esta patologia. A diminuição da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO), metabolito crucial para a homeostasia vascular, é uma manifestação-chave da disfunção endotelial que precede a aterosclerose, e um fenótipo consistentemente associado aos estados de HHcy. Contudo, os mecanismos pelos quais níveis aumentados de homocisteína induzem a disfunção endotelial, apesar de intensamente estudados, não se encontram completamente elucidados. A S-adenosil-homocisteína (AdoHcy) é o precursor metabólico de toda a homocisteína produzida no organismo, e um inibidor da maioria das metiltransferases celulares. Por esta razão, tem sido sugerido um mecanismo indirecto para a toxicidade da homocisteína, secundário a uma acumulação de AdoHcy, e a uma possível alteração dos processos celulares de transmetilação. Com efeito, e independentemente da causa subjacente, a níveis elevados de homocisteína corresponderá uma acumulação de AdoHcy, que poderá perturbar os processos de metilação celular, nomeadamente do DNA e das proteínas, daí resultando consequências fisiológicas importantes. Deste modo, o papel da AdoHcy tem vindo a assumir uma relevância crescente na patofisiologia da HHcy. De facto, dados recentes, quer experimentais quer clínicos, sugerem que a AdoHcy possa vir a ser considerada como o biomarcador adicional à Hcy, ou mesmo de excelência, para a susceptibilidade à doença vascular. Neste trabalho, postulamos então que o aumento dos níveis de homocisteína não são directamente o factor causador de doença vascular, mas sim a acumulação de AdoHcy secundária a esse aumento de homocisteína, a qual, por inibição de mecanismos de metilação celular, nomeadamente, da metilação do DNA e/ou das proteínas, poderá influenciar o metabolismo do NO e/ou do seu principal inibidor endógeno, a dimetilarginina assimétrica (ADMA), diminuindo assim a biodisponibilidade de NO e promovendo a disfunção endotelial. Para testar a nossa hipótese de trabalho, usámos como modelo de estudo, numa primeira abordagem, culturas de células endoteliais humanas. Os dados obtidos através destas experiências ex vivo, foram posteriormente confirmados in vivo, nomeadamente em situações de HHcy quer endógena, em doentes com alterações hereditárias do metabolismo da homocisteína (défice em cistationina β-sintase, CBS), quer induzida, em animais sujeitos a dietas com teores manipulados em co-enzimas e co-factores intervenientes no metabolismo da homocisteína. O Primeiro Capítulo da presente tese inclui uma revisão geral do metabolismo da homocisteína, incluindo os principais conceitos referentes à regulação, determinantes do estado de HHcy e mecanismos propostos como reponsáveis pela sua associação com a disfunção endotelial, nomeadamente o involvimento das vias metabólicas do NO e da ADMA. Finalmente, é apresentada uma revisão global dos principais mechanismos epigenéticos, e exemplos actualizados de estudos referentes ao papel da homocisteína na modulaçao da metilação do DNA e expressão génica. O Capítulo 2 apresenta os principais objectivos de trabalho e o delineamento dos capítulos constituintes desta tese. O primeiro objectivo do trabalho consistiu então na avaliação do efeito de um ambiente celular hipometilante sobre a biodisponibilidade do NO (Capítulo 3). Para tal, recorremos a células endoteliais isoladas da veia do cordão umbilical (HUVEC) para estabelecer o modelo de estudo. Assim, as culturas celulares foram tratadas com adenosina-2,3-dialdeído (ADA), um potente inibidor da AdoHcy hidrolase (enzima que converte a AdoHcy em homocisteína), que induziu efectivamente uma acumulação exclusiva de AdoHcy. Verificámos que a produção de NO diminuía, devido a uma diminuição do teor proteico da isoforma endotelial do NO sintase (eNOS) e da sua actividade enzimática, embora a transcrição do respectivo gene estivesse aumentada. Em conjunto, estes dados apontam para a existência de mecanismos pós-transcricionais, modulados pelo potencial de metilação celular alterado e induzido pela acumulação de AdoHcy, os quais conduzem a uma diminuição da produção de NO. Sendo os processos de metilação celular, nomeadamente do DNA, um tema central deste trabalho, importava utilizar o método mais correcto para os avaliar. Assim, no Capítulo 4 fomos comparar dois dos métodos mais utilizados para esta quantificação: um método tradicional, fundamentado no uso de enzimas de restrição sensíveis à metilação, e um método mais recente, baseado na hidrólise química do DNA seguida da detecção específica das citosinas metiladas. Os resultados revelaram que ambos os métodos possibilitam uma quantificação fiável do grau de metilação do DNA, mas que o último método, cujo processo de detecção usa a espectrometria de massa em tandem, apresenta sólidas vantagens pois, ao invés do método enzimático que oferece uma quantificação relativa, permite uma quantificação absoluta da metilação global do DNA e apresenta menores variações intra-dias. Por esta razão, o método LC-MS/MS foi o método eleito para os estudos posteriores. A ADMA é um inibidor endógeno da síntese de NO endotelial, logo o seu metabolismo assume particular importância no contexto da homeostasia vascular. O objectivo seguinte, apresentado no Capítulo 5, pretendeu elucidar o efeito do ambiente hipometilante ao nível do metabolismo da ADMA, e especificamente sobre a enzima responsável pela sua hidrólise, a dimetilarginina dimetilamino-hidrolase (DDAH). As culturas de HUVEC foram tratadas em paralelo com ADA e com 5-aza-2-deoxicitidina (AZA), um inibidor específico das DNA metiltransferases e que não induz acumulação de AdoHcy. Embora os dois fármacos utilizados induzissem uma hipometilação do DNA, os resultados revelaram que apenas o tratamento com ADA aumentou a actividade da DDAH, reflectindo-se numa diminuição dos teores de ADMA extracelulares. Assim, os nossos dados sugerem que a acumulação intracelular de AdoHcy estimula a actividade da DDAH por um mecanismo independente da metilação do DNA. No Capítulo 6 fomos analisar os efeitos da acumulação intracelular de AdoHcy no estado de metilação das proteínas, o qual foi avaliado indirectamente pela quantificação dos resíduos metilados de arginina, nomeadamente ADMA e dimetilarginina simétrica (SDMA). Surpreendentemente, os resultados revelaram que a metilação das proteínas é mais susceptível de alteração devido à acumulação intracelular de AdoHcy do que a metilação do DNA. Estes dados são de grande interesse, pois sugerem que a metilação das proteínas poderá ser um novo interveniente na patofisiologia da HHcy. Com efeito, a metilação de proteínas é um regulador emergente da função proteica crescentemente implicado na fisiopatologia humana. No Capítulo 7 fomos analisar as consequências in vivo de uma situação de HHcy na metilação do DNA. Para tal, induzimos em ratos uma gama variável de níveis de homocisteína através de dietas ricas em metionina e/ou pobres em vitaminas do grupo B, e fomos analisar os seus reflexos ao nível dos padrões de metilação do DNA em diversos órgãos. Os resultados revelaram que dietas indutoras de HHcy afectam a capacidade de metilação celular, mas que o seu reflexo a nível do DNA está dependente dos níveis de AdoHcy atingidos e sobretudo do tecido em causa, nomeadamente da presença ou ausência de vias metabólicas específicas. Os dados por nós obtidos nas anteriores experiências ex vivo contradizem diversas publicações que referem um aumento concomitante de homocisteína e de ADMA em doentes cardiovasculares. Assim, pretendemos investigar o que acontece in vivo em doentes com deficiência em CBS, nos quais se verifica uma situação de HHcy crónica associada a risco elevado de doença vascular (Capítulo 8). Os resultados revelaram uma ausência de correlação entre os níveis plasmáticos de homocisteína e de ADMA, o que sugere que a acumulação destes dois metabolitos resulta de mecanismos patogénicos independentes. No entanto, verificou-se que nestes doentes os níveis de arginina e a razão arginina/ADMA (indicador da taxa de inibição da síntese de NO) se encontravam diminuídos. Estes dados corroboram os obtidos na experiência anterior efectuada em culturas celulares, e sugerem que a elevação de ADMA nos doentes vasculares é independente do aumento dos níveis de homocisteína, e estará provavelmente relacionada com outros factores, tais como disfunção renal. Por último, no Capítulo 9 é apresentada uma discussão dos resultados obtidos, incluindo a análise integrada de todo o trabalho e respectivas conclusões, bem como algumas perspectivas de trabalho futuro. Em resumo, este trabalho contribuiu para a elucidação do envolvimento da acumulação de AdoHcy e consequente alteração do padrão de metilação celular no mecanismo patogénico subjacente à toxicidade vascular da homocisteína.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/41970/2007, SFRH/BD/48585/2008, PTDC/SAU-GMG/68714/2006, PTDC/SAU-ORG/112683/2009