Speciation in spatially structured populations : identifying genes responsible for local adaptation

Tese de doutoramento, Biologia (Biologia Evolutiva), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012The determination of the genetic basis of adaptive traits in natural populations is fundamental to better understand how populations adaptively diverge in heterogeneous environments and eventually give rise to new species. This work describes the efforts to identify candidate loci influenced by selection in ocellated lizards (Lacerta lepida) along an environmental gradient in the Iberian Peninsula, strongly affected by climatic variables. Two subspecies are recognized at the opposite extremes of the gradient, L. l. iberica in the northwest and L. l. nevadensis in the southeast, with morphological differences that suggest their local adaptation. Candidate loci were detected through an AFLP genome scan. Detection of candidate loci with a frequentist method and with Bayesian method resulted in a similar proportion of outliers (3-4%), but only a few loci were detected by both methods, denoting differences in methods’ sensitivity. Several outliers were associated with variation in temperature, insolation or precipitation along the gradient, suggesting the importance of these variables as selective pressures for local adaptation. Seven outliers were successfully characterized, being noncoding, with internal indels or repetitive elements as causes of length polymorphism, indicating that they might act as regulatory elements or are in linkage with the actual target of selection. The analysis of Mc1r, a candidate gene for coloration, revealed a nonconserved and derived substitution (T162I) associated with the brownish colour phenotype of L. l. nevadensis, suggesting a putative partial loss of function. Another substitution (S172C) was associated with the presence of black scales in both L. l. lepida and L. l. iberica, but no mutations were associated with the higher melanization of L. l. iberica. Analysis of genetic structure showed that L. l. nevadensis divergence is well supported by both neutral and non-neutral loci, confirming that the subspecies is at the final stages of its speciation process. L. l. iberica divergence from the nominal subspecies is mostly explained by a few adaptive loci, indicating that L. l. iberica might be at the early stages of ecological speciation.A determinação da base genética de caracteres adaptativos em populações naturais é fundamental para melhor compreender a evolução da divergência adaptativa entre populações em ambientes heterogéneos e a forma como estas podem evoluir para formar novas espécies. O presente trabalho teve como principal objectivo a identificação de genes ou regiões genómicas envolvidas na adaptação local em populações espacialmente estruturadas, mas na ausência de barreiras físicas evidentes ao fluxo genético entre elas. O lagarto ocelado (ou sardão), Lacerta lepida, foi o modelo escolhido para este estudo, tendo sido analisadas populações ao longo de um gradiente ambiental na Península Ibérica, que é sobretudo condicionado pela variação climática. Duas subespécies de sardão são actualmente reconhecidas nos extremos opostos do gradiente ambiental, tendo por base a existência de diferenças morfológicas significativas, que sugerem a sua adaptação às condições ambientais locais. A subespécie L. l. iberica encontra-se restringida ao Noroeste da Península Ibérica, enquanto que a subespécie L. l. nevadensis substitui a subespécie nominal no Sudeste da área de distribuição da espécie. Como primeira abordagem para a detecção de regiões do genoma sob acção da selecção, foi realizado um genome scan com AFLPs. Esta estratégia permite gerar centenas de marcadores genéticos em qualquer organismo, distribuídos pelo genoma, sem que para tal seja necessário ter conhecimento genético prévio da espécie, sendo por isso muito útil para espécies não-modelo, como o sardão, com poucos recursos genómicos disponíveis. A identificação de loci candidatos foi feita mediante a detecção de outliers, isto é, de marcadores de AFLP com níveis de diferenciação entre populações, anormalmente elevados (selecção direccional) ou reduzidos (selecção balanceada) de acordo com o expectável num cenário de neutralidade. Foram utilizados dois métodos de detecção, um método frequencista e um método Bayesiano, e embora ambos tenham detectado um proporção semelhante de outliers (3-4%), apenas alguns dos outlieres foram detectados por ambos, denotando diferenças na sensibilidade dos dois métodos. Vários dos AFLPs detectados como outliers foram também associados com a variação na temperatura, na insolação ou na precipitação registadas ao longo do gradiente, sugerindo que estas variáveis poderão ser importantes forças selectivas ao nível da adaptação local do sardão. Devido à susceptibilidade dos métodos de detecção de outliers aos erros de tipo I (falsos-positivos), que embora podendo ser controlados, dificilmente poderão ser totalmente eliminados, os outliers deverão ser tratados como loci candidatos, potencialmente influenciados pela selecção, que deverão ser posteriormente validados por outros meios. Como os AFLPs são marcadores gerados a partir da fragmentação do genoma pela acção de enzimas de restrição, tratam-se de marcadores com localização desconhecida no genoma e a sequência de DNA que constitui cada fragmento permanece completamente anónima durante todo o processo de genotipagem, sendo estes distinguidos apenas pelas diferenças de tamanho e genotipados como marcadores dominantes. Assim sendo, é muito importante que depois de indentificar os AFLPs com comportamento outlier, estes sejam investigados por forma a indentificar as sequências que os constituem e determinar a que genes poderão pertencer e quais as suas possíveis funções. O isolamento de AFLPs com tamanho específico de entre dezenas de outros fragmentos com tamanho semelhante é tecnicamente exigente. Sete outliers foram isolados, clonados e sequenciados com sucesso, mas nenhum deles parece fazer parte de uma região codificante, sendo o polimorfismo de tamanho dos fragmentos explicado pela presença de indels ou elementos repetitivos (microssatélites). Para cada outlier sequenciado foram desenhados primers internos de forma a converter estes loci em marcadores codominantes e poder amplificá-los a partir do genoma não digerido. Devido ao reduzido tamanho dos fragmentos, apenas para três dos sete outliers sequenciados (mk75, mk209 e mk245) foi possível desenvolver primers capazes de amplificar tanto os alelos dominantes como os alelos recessivos. Para o locus mk75, um outlier associado à variação na precipitação, foram detectados um haplótipo dominante conservado, com uma deleção de nove pares de bases, e oito haplótipos recessivos. A frequência do alelo dominante é superior em L. l. iberica enquanto que em L. l. nevadensis ele se encontra ausente. O locus mk209, também associado com a precipitação, apresentou dois haplótipos dominantes, caracterizados pela inserção de quatro bases (TGGA), e sete haplótipos recessivos. Todas os indivíduos de L. l. nevadensis sequenciados para o locus mk209 apresentaram apenas haplótipos dominantes, enquanto que estes estão ausentes em todas as amostras sequenciadas para as restantes subespécies. Relativamente ao locus mk245, detectado em forte associação com a variação nas temperaturas máximas ao longo um microssatélite com seis repetições de GTT, e oito haplótipos recessivos com três a cinco repetições de GTT. O haplótipo dominante não foi encontrado nos indivíduos de L. l. iberica nem de L. l. nevadensis, sendo que ambas as subespécies apresentaram apenas sequências com três repetições de GTT, embora estas se encontrem em extremos opostos do gradiente de temperatura. Os outliers mk75, mk209 e mk245 foram ainda amplificados e sequenciados com sucesso em espécies próximas (Lacerta tangitana, L. pater, L. schreibei, L. agilis e Iberolacerta monticola), evidenciando que apesar da variação de tamanho nos elementos repetitivos, as zonas que os flanqueiam permanecem bastante conservadas entre espécies. Tratando-se de regiões não codificantes, os outliers sequenciados para o lagarto ocelado poderão actuar como elementos reguladores da actividade de alguns genes ou poderão estar em desequilíbrio de linkage com outros genes que serão o verdadeiro alvo de selecção. Em qualquer dos casos, serão necessários mais recursos genómicos para compreender o papel destes outliers na evolução do lagarto ocelado. A análise de genes candidatos, com efeitos conhecidos nas características fenotípicas de outras espécies, pode constituir uma alternativa ao genome scan para a identificação de genes importantes na adaptação local do lagarto ocelado. A coloração dorsal constitui uma das características morfológicas que varia substancialmente entre as subespécies de L. lepida, tendo possíveis consequências adaptativas ao nível da camuflagem ou da eficiência da termorregulação. O receptor da melanocortina 1 (Mc1r) é um gene envolvido na síntese de melanina e, como tal, constitui um importante candidato para a variação na proporção de escamas pretas ou castanhas entre os lagartos ocelados. A análise do Mc1r em L. lepida revelou uma susbtituição derivada e não conservativa na cadeia de aminoácidos (T162I), que se encontra associada com a coloração acastanhada de L. l. nevadensis, sugerindo que a mutação poderá conduzir a uma perda parcial da função do gene. Uma segunda substituição (S172C) foi detectada em associação com aprevalência de escamas pretas em L. l. lepida e em L. l. iberica. No entanto, não foi detectada qualquer mutação no gene Mc1r associada com a maior proporção de escamas pretas em L. l. iberica, implicando que tal differença se deva a mutações regulatórias que afectem a expressão do gene Mc1r ou a mutações noutros genes envolvidos na pigmentação. Os resultados da análise do gene Mc1r no lagarto ocelado constituem a primeira contribuição para a determinação da base genética da variação na coloração desta espécie e serão úteis no delineamento da investigação futura. As consequências da funcionais das mutações detectadas neste estudo deverão ser testadas com ensaios in vitro de forma a confirmar a sua associação com os fenótipos de cor do sardão. Os dados obtidos neste estudo para o lagarto ocelado a partir de um grande número de marcadores nucleares confirmam a previsão inicial de que a evolução da espécie é congruente com a perspectiva génica do processo de especiação, encontrando-se cada subspécie em diferentes estádios de divergência. A análise da estrutura genética do lagarto ocelado foi realizada com base em 318 marcadores neutrais de AFLPs, 23 marcadores não-neutrais de AFLPs (ambos gerados pelo genome scan) e em oito microssatélites. A divergência de L. l. nevadensis é bem suportada tanto pelos marcadores neutrais como pelos não-neutrais, confirmando que a subespécie se encontra nos estádios finais do processo de especiação. Por outro lado, a divergência de L. l. iberica é sobretudo explicada pelos marcadores não-neutrais, enquanto que a homogeneidade genética ao nível dos marcadores neutrais implica a ocorrência generalizada de fluxo genético, sugerindo que a subespécie se encontra nos estádios iniciais da especiação ecológica, quando o processo de divergência é ainda reversível. Relativamente à subspécie nominal, e embora estudos anteriores tenham detectado vários clades mitocondriais na área geográfica de L. l. lepida, estes não são totalmente suportados pelos marcadores nucleares analisados neste estudo. A incongruência entre os marcadores mitocondriais e nucleares pode ser justificada pela recente divergência dos referidos clades e por incomplete lineage sorting ao nível dos marcadores nucleares, embora a ocorrência de fluxo genético nas zonas de contacto entre os clades também possa contribuir para a homogeneização da variação genética entre as populações de L. l. lepida.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/21306/2005 e projetos POCI/BIA/59288/2004, POCTI/BSE/47999/2002