New tools for improving culture strategies for Hepatocyte differentiation

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011O fígado é um órgão de enorme importância fisiológica e metabólica. Os hepatócitos, que constituem cerca de 80% da massa total de fígado, são frequentemente expostos a agentes tóxicos podendo levar à sua perda, limitando a função hepática 1. Apesar da capacidade regenerativa destas células, o recurso ao transplante de fígado é frequente, no entanto, o número de dadores disponíveis é um factor limitante desta terapia. Os hepatócitos primários humanos e dispositivos hepáticos bioartificiais (BAL) podem ser utilizados como alternativa terapêutica. Porém, a reduzida capacidade proliferativa ex vivo dos hepatócitos, a perda do perfil de expressão hepática e da sua funcionalidade limitam o seu potencial terapêutico, aquando mantidos em cultura ao longo do tempo 2. Estas células possuem ainda um enorme potencial no desenvolvimento de novos modelos in vitro para ensaios pré-clínicos, na descoberta de novos fármacos e em testes toxicológicos. Em terapias hepáticas têm sido utilizadas fontes alternativas de células do fígado, nomeadamente, progenitores hepáticos (com capacidade de maturar em hepatócitos e colangiócitos, as principais células presentes no fígado), células estaminais da medula óssea e células estaminais embrionárias (CEEs). Apesar de todas estas fontes alternativas apresentarem limitações na produção de hepatócitos, as células estaminais embrionárias humanas (CEEhs) são consideradas uma potencial fonte ilimitada de células com uma enorme aplicabilidade neste tipo de terapias. Vários estudos têm mostrado a capacidade destas originarem células com características hepáticas3,4. Os processos de diferenciação hepática a partir de CEEhs reflectem o desenvolvimento do fígado in vivo, onde, numa primeira fase, as CEEhs originam células de endoderme definitiva (ED). Estas por sua vez diferenciam-se em progenitores hepáticos que maturam dando origem aos hepatócitos adultos. Têm sido desenvolvidos protocolos que visam melhorar as condições de cultura com posterior optimização da diferenciação, tais como o recurso a factores de crescimento essenciais para a diferenciação ou ao uso de uma matriz extracelular (MEC), que constitui uma rede de macromoléculas que influencia a migração, a polarização e, consequentemente, a funcionalidade das células. Contudo, estes protocolos apresentam duas grandes desvantagens: (1) o número de hepatócitos produzidos a partir de CEEhs durante o processo de diferenciação é insuficiente para posterior aplicação em BAL (para o qual são necessários 10 mil milhões de hepatócitos) e (2) o tipo de células obtido no final da diferenciação não revela um fenótipo caracteristico de hepatócitos maduros, apresentando uma população altamente heterogénea de células indiferenciadas, progenitoras e com carácter maduro. Portanto, o processo de diferenciação hepática necessita de ser optimizado, de modo a aumentar significativamente o rendimento de hepatócitos funcionais e a pureza da população obtida no final do mesmo. Numa perspectiva de optimização, a monitorização de todo o processo de diferenciação é essencial para caracterizar e identificar as células específicas de cada etapa do mesmo, permitindo deste modo avaliar de forma precisa a sua eficiência. Actualmente, as técnicas existentes para esta caracterização são invasivas, morosas e inadequadas quando se pretende definir da melhor forma a optimização do bioprocesso. Como alternativa têm sido desenvolvidas estratégias para modificar geneticamente as CEEhs, como por exemplo, o uso de genes repórter fluorescentes, para marcar especificamente um determinado tipo celular proveniente de CEEhs. A introdução destes genes fluorescentes, sob o controlo de promotores específicos de cada tipo celular torna possível essa marcação específica, tirando partido de técnicas não-invasivas. Um dos genes repórter mais utilizado é a variante da proteína verde fluorescente (eGFP; do inglês, enhanced Green Fluorescent Protein). Ultimamente, têm sido publicados alguns estudos que utilizam esta técnica para identificar e isolar uma linhagem derivada de CEEhs. Apesar da utilidade desta técnica na optimização do processo de diferenciação, continua a ser necessário o desenvolvimento de uma estratégia que monitorize em tempo-real todas as etapas deste processo. Tendo em conta as etapas cruciais durante o desenvolvimento do fígado, é possível visualizar e acompanhar todo o processo recorrendo à expressão de dois genes repórter, controlados por diferentes sequências reguladoras específicas de cada etapa do desenvolvimento. Os métodos mais utilizados para transferência génica são os vectores virais, em particular os vectores lentivirais (VLs) baseados no Vírus da Imunodeficiência Humana (VIH), devido à sua eficiência na transferência génica e expressão estável ao longo do tempo. Estes vectores demonstram também maior resistência ao silenciamento em CEEs, comparativamente aos restantes vectores virais, sendo uma poderosa ferramenta na transferência génica nestas células. Assim, foram desenvolvidos vectores lentivirais inactivados (SIN; do inglês, Self-Inactivating), caracterizados por possuirem uma delecção na região U3 da longa repetição terminal a 3‟ (LTR; do inglês, Long Terminal Repeat) de modo a que a expressão do genoma viral na célula hospedeira seja controlada apenas pelos promotores exogenos, que controlam a expressão dos genes repórter, levando à perca da capacidade replicativa dos vectores lentivirais e tornando-os deste modo seguros. Neste contexto, desenvolveu-se uma nova ferramenta baseada na construção de vectores lentivirais inactivados duplo-repórter (VLs-SIN), que contém dois genes repórter, Cherry e eGFP, controlados por promotores independentes que permitem a monitorização em tempo-real das principais etapas. Inicialmente, para comprovar a presença de duas unidades transcripcionais independentes no sistema desenvolvido, foram clonados dois promotores constitutivos para regularem a expressão dos dois repórteres. A expressão de cada repórter é controlada apenas pelo promotor a montante do mesmo, evidenciando uma expressão independente. Por outro lado, uma célula que ostenta o vector duplo, com os dois genes repórter a serem transcritos por dois promotores independentes mas activos no mesmo espaço temporal (neste caso, promotores de genes constitutivos), co-expressa os dois genes fluorescentes. Após a validação inicial deste sistema e com a produção dos VLs-SIN, a clonagem suplementar de sequências de poliadenilação (uma sequência de poliadenilação sintética seguida de uma sequência espaçadora não codificante) entre as duas unidades transcripcionais levou à optimização do nível da expressão dos dois repórteres, diminuindo a variação da expressão de ambos, quando expressos constitutivamente na população genéticamente modificada. Por outro lado, a desvantagem apresentada pela proteína vermelha fluorescente DsRED em relação às proteínas vermelhas fluorescentes monoméricas, como por exemplo a mCherry, levou-nos à substituição do gene repórter DsRED pelo gene que codifica a proteína mCherry. Esta proteína apresenta uma maior foto-estabilidade, sendo um factor crítico na monitorização ao longo do tempo. No entanto, apesar da diminuição da expressão deste repórter em relação ao nível de expressão apresentado pela DsRED, a conjugação dos repórteres mCherry e eGFP no sistema duplo-repórter mostrou ser a mais promissora. Assim, foram desenvolvidos três VLs-SIN duplo-repórter (mCherry e eGFP) para transferência génica de marcadores específicos das etapas cruciais do processo de diferenciação hepática. Os promotores clonados mostraram especificidade e eficácia na expressão dos repórteres durante o processo de validação numa linha celular de hepatocarcinoma humano HepG2. Esta linha celular é normalmente utilizada como modelo in vitro em estudo de metabolismo de hepatócitos humanos devido à sua capacidade de expressar genes hepáticos fetais. Os resultados obtidos demonstram a capacidade desta nova ferramenta em caracterizar e identificar as células específicas de cada etapa da diferenciação de CEEhs em hepatócitos. Este sistema poderá permitir a monitorização da diferenciação numa linhagem específica, e de uma forma mais eficaz a optimização de todas as condições de cultura para expansão e diferenciação. Por outro lado, esta nova ferramenta desenvolvida mostrou-se promissora quanto à posterior aplicação em estudos do perfil de expressão génica para monitorizar a resposta a determinados estímulos. Assim, este estudo contribuirá futuramente para o progresso no campo da biologia das células estaminais e sua aplicabilidade.Owing the scarcity of human hepatocytes for application in the pre-clinical drug development and bioartificial liver (BAL) devices, human embryonic stem cells (hESCs) presents a great potential for the production of hepatocytes through the hepatic differentiation process. However, this often results in not fully functional final cell type obtained and low-yield, which presently are the main limitations of the differentiation process. Furthermore, the traditional methods for identification of stage-specific cell type are based on time-consuming and invasive methodologies that are not a practical approach when the goal is bioprocess optimization aiming for the generation of well-defined cell populations. The analysis of hESCs differentiation stages would therefore greatly profit from in vivo and real-time monitoring methodologies. In this work, we designed a series of dual-reporter Self-Inactivating Lentiviral Vectors (SIN-LVs) carrying two independent transcriptional units to be expressed in vivo during different stages of hepatocyte differentiation. These SIN-LVs were validated in human hepatocellular liver carcinoma cell line HepG2 suitable as an in vitro model system for the study of human hepatocytes and the promoters‟ specificity were confirmed. This design enables a reliable and efficient visualization and trafficking of stem cells and their derivatives using live imaging non-invasive techniques, contributing for debottlenecking the optimization of hepatocyte differentiation and expansion conditions. Additionally, cells expressing these markers can also be extremely valuable tools for basic studies of stem cell biology and pre-clinical drug development