Detection and localization of LysA and GP1 proteins of the mycobacteriophage Ms6

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Bacteriófagos, ou fagos, são vírus que infectam bactérias. Estes organismos são dez vezes mais numerosos do que as bactérias no meio ambiente, sendo estes as entidades mais abundantes na Terra. Os fagos desempenham um grande papel no equilíbrio ecológico da vida microbiana. O estudo dos bacteriófagos, teve início em 1915 por Frederick Twort quando este isolou das fezes de um paciente com disenteria um “agente infeccioso e filtrável”. Mais tarde, em 1918, D’Herelle descobriu uma entidade “antagonista” de bactérias, que provocava a sua lise em culturas líquidas e levavam à formação de placas de lise na superfície de meios de cultura com agar semeados com bactérias. D'Herelle criou a designação de bacteriófago para denominar os “vírus que comem bactérias”. Apesar de até a data já terem sito descritos inúmeros fagos, apenas alguns têm sido estudados com algum detalhe. Relativamente à natureza dos ácidos nucleicos, os fagos podem apresentar um genoma quer de ADN de cadeia dupla, ADN de cadeia simples, ARN de cadeia dupla ou ARN de cadeia simples e normalmente o genoma é encapsulado em um invólucro proteico denominado cápside. A maioria dos fagos descritos até à data, apresentam cauda e um genoma de ADN de cadeia dupla (aproximadamente 96%). Existe uma variada gama de diferentes tipos de morfologia nos fagos e a sua taxonomia é baseada nos vários tipos de morfologia, presença ou ausência de envelope, pelo seu tamanho e pelo seu tipo de ácido nucleico. A classificação actual é derivada de um esquema proposto por Bradley em 1967. Presentemente a classificação inclui uma ordem, 14 famílias oficialmente aceites e 37 géneros. Os bacteriófagos, como todos os parasitas obrigatórios, requerem células hospedeiras para se manter e se reproduzir, aproveitando-se dos seus mecanismos de biossíntese para sobreviver. Com base no tipo de ciclo de vida, os bacteriófagos podem ser de dois tipos: fagos líticos, que apresentam um ciclo de vida lítico; ou fagos temperados, que apresentam ciclo de vida lisogénico e lítico. No ciclo lítico, o fago redirecciona o metabolismo do hospedeiro para a produção de novos vírus, que são libertados durante a lise celular provocada pelos vírus. No ciclo lisogénico, o genoma do fago é inserido no genoma do hospedeiro e sendo então replicado quando o genoma do hospedeiro se replica até que o ciclo lítico seja induzido, por exemplo por agentes mutagénicos. Para iniciar a infecção, os fagos necessitam adsorver à superfície bacteriana, através do reconhecimento de receptores presentes na parede celular e posteriormente ocorre a entrada do genoma viral na célula hospedeira. Após a injecção do genoma viral, este é transcrito pelas polimerases do hospedeiro eventualmente há produção de novas partículas virais pela maquinaria do hospedeiro. Quando o ciclo lítico sucede, na maioria dos casos é necessário ocorrer lise da célula para que os novos viriões possam encontrar novos hospedeiros. Os fagos de ADN de dupla cadeia desenvolveram um sistema de lise em que utilizam uma estratégia denominada “holinaendolisina” para realizar uma lise celular eficiente no hospedeiro. O fago Ms6 é um micobacteriófago temperado, com genoma constituído por ADN de cadeia dupla, que infecta a bactéria Mycobacterium smegmatis. Os micobacteriófagos representam excelentes sistemas modelo para estudar micobactérias hospedeiras. Estes bacteriófagos têm vindo a desempenhar um papel fundamental no desenvolvimento de sistemas genéticos para o estudo da patogénese molecular das micobactérias patogénicas para o homem, sendo as espécies mais reconhecidas Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae, os agentes causadores da tuberculose e lepra, respectivamente. Mycobacterium smegmatis é considerada uma micobactéria não-patogénica representando assim um bom modelo de estudo. O micobacteriófago Ms6, sendo de cadeia dupla, utiliza a estratégia “holina-endolisina” para induzir uma lise efectiva do hospedeiro. As endolisinas são enzimas muralíticas com actividade hidrolítica das ligações específicas que se estabelecem na camada de peptidoglicano e as holinas são proteínas membranares de pequenas dimensões, que conduzem a uma alteração do potencial de membrana como consequência da abertura de poros na membrana, actuando assim como controladora da activação da endolisina ou permitindo o seu acesso à mureína. Na maioria dos casos descritos até à data, o acesso da endolisina ao seu alvo é feito pela passagem através dos poros formados pela holina. Actualmente têm sido descritos fagos que produzem endolisinas cujo transporte para o meio extracitoplasmático é independente da holina, utilizando os sistemas de transporte bacterianos. Estas endolisinas apresentam na sua estrutura uma sequência sinal, que permite a translocação da proteína, através da membrana citoplasmática, utilizando o sistema sec (translocase) do hospedeiro, até ao espaço periplásmico. Foram já descritas endolisinas que apresentam na região N-terminal um péptido sinal, como é o caso da Lys44 produzida pelo fago fOg44 de Oenococcus oeni. Recentemente foram descobertas outras endolisinas, de fagos que infectam bactérias Gram-negativas, que apresentam na sua extremidade N-terminal uma região de carácter hidrofóbico, designada por Signal-Arrest-Release (SAR), que permite igualmente, o transporte da endolisina através da membrana citoplasmática com o auxílio do sistema sec,, com a particularidade de não ser clivada. Apesar de nestes casos a holina não participar no transporte da endolisina, pensa-se que esta possa desempenhar um papel na activação de lisinas que se encontram no espaço periplásmico e na determinação do tempo de lise. A cassete lítica do fago Ms6 é constituída por 5 genes. Para além dos genes da endolisina (lysA ou gp2) e holina (hol ou gp4), a cassete lítica do Ms6 inclui mais 3 genes, gp1, gp3 e gp5. Catalão e colegas (2010) mostraram que a endolisina LysA é exportada com a ajuda do produto do gene gp1, de uma forma independente da holina. É demonstrado que o gene gp1 codifica uma proteína “chaperone-like” que se liga à endolisina, auxiliando a sua exportação para o ambiente extracitoplasmático, o que é necessário para uma eficiente lise do fago Ms6. Actualmente não se sabe como o endolisisna permanece inactiva até a holina determinar o tempo de lise. Assim, o objectivo principal deste trabalho foi investigar o papel do produto do gene gp1 no transporte de LysA e outras proteínas sem péptido sinal, para o periplasma. Para alcançar este objectivo, construiu-se um fago Ms6 mutante onde o gene gp1 contém na sua extremidade 3 ' uma sequência que codifica para uma cauda C-Myc permitindo a produção de uma proteína recombinante Gp1-C-Myc. Esta proteína foi detectada com o anticorpo anti C-Myc na fracção solúvel e membranar quando células de M. smegmatis foram infectadas com o fago mutante Ms6Gp1-CMyc. O mesmo resultado foi obtido em E.coli confirmando que Gp1 se distribui entre os compartimentos solúveis e membranares. Para apoiar este resultados foram utilizados duas proteínas repórter, a fosfatase alcalina bacteriana (PhoA) como repórter para a localização periplasmática e a proteína verde fluorescente (GFP) como repórter para a localização citoplasmática. A capacidade de Gp1 translocar proteínas foi também apoiada pelo resultado obtido com fusões com a PhoA e GFP. Os resultados da fusão da Gp1-PhoA revelaram actividade da fosfatase alcalina, enquanto a fusão Gp1- GFP resultou em perda de emissão de fluorescência. Na experiência realizada com a proteinase K obteve-se um perfil alterado de proteínas quando LysA foi sujeita a um tratamento com proteinase K, sugerindo que a LysA pode estar localizada no periplasma na presença de Gp1. Os resultados apresentados reforçam o papel da Gp1 em auxiliar outras proteínas, sem um péptido sinal, para atravessar a membrana para o periplasma. Os resultados obtidos neste trabalho experimental abrem novas perspectivas no sentido de oportunidades para novos estudos em vias de secreção de micobactérias. Também uma melhor caracterização do genoma dos bacteriófagos poderá levar a contribuição para a identificação de novos alvos terapêuticos na parede das micobactérias.Bacteriophages are viruses that infect bacteria. The majority described to date ( 96%) are endowed with a tail and contains a double-stranded DNA (dsDNA) genome. The phage Ms6 is a temperate phage that infects Mycobacterium smegmatis. Like dsDNA phages, Ms6 uses the holinendolysin mechanism to accomplish lysis of the host. In addition to endolysin (lysA) and holin (hol) genes, Ms6 genome encodes three accessory lysis proteins, Gp1, LysB and Gp5. Endolysins are proteins that degrade the rigid murein layer, and holins are small membrane proteins that control the activation of the endolysin or its access to the murein. Recently it has been shown that the endolysin LysA is exported with the help of the gp1 gene product, which is involved in its delivery to the peptidoglycan, in a holinindependent manner. Thus, the purpose of this project is to investigate the role of gp1 gene product in the transportation of LysA and other proteins without a peptide signal, to the periplasm. To achieve this we constructed a mutant Ms6 phage where the gp1 gene carries, at its 3’ end, a sequence coding for a CMyc tag allowing the production of a recombinant protein that was detected with an antibody anti C-Myc in the soluble and membrane fraction of M. smegmatis infected cells. The same result was obtained in E.coli confirming that Gp1 distributes between the soluble and membrane compartments. The ability of Gp1 to translocate proteins is suggested by the obtained result with alkaline phosphatise (PhoA) and green fluorescence protein (GFP) fusions. A Gp1-PhoA fusion results in alkaline phosphatase activity while a Gp1-GFP fusion results in loss of fluorescence emission. In addition, an altered profile of the proteins when LysA is subject to a proteinase K treatment suggests that LysA may be periplasm localized in the presence of Gp1. The results presented here strengthen the role of Gp1 in helping other proteins, without a peptide signal, to cross the membrane to the periplasm