Cytological, physiological and molecular characterisation of sparkling wine yeasts

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Sparkling wines represent a distinctive wine type and are highly valued worldwide. They are produced through a second alcoholic fermentation of a base wine, performed by selected strains of Saccharomyces cerevisiae, inside a closed vessel, which in the case of the traditional method is the bottle ultimately delivered to the consumer. Once in the base wine and during the second fermentation, yeasts are forced to endure very stressful conditions, such as high ethanol contents (8-12%) and temperatures usually below 16ºC. Very low temperatures (9-10ºC), not uncommon in large underground cellars, are particularly problematic, being an important cause of sluggish or stuck fermentations even when yeasts are properly acclimatized before inoculation. The work herein described had the objective of studying sparkling wine yeasts’ physiological changes and adaptation behaviour under very low temperature in-bottle second fermentations. For the purpose, two yeast strains and two base wines were used in small scale in-bottle second fermentations at 10ºC, mimicking actual traditional method production conditions. Each strain was separately inoculated into each of both base wines, and in all four experimental conditions a multiparametric characterisation was conducted throughout the fermentation process. This characterisation, broad and integrative, focused on a number of cytological, physiological and molecular properties of yeasts, intending to thoroughly assess the evolution and heterogeneity of their vitality and adaptation state. Parameters evaluated were: viability, fermentation kinetics, total proteins, trehalose, glycogen, neutral lipids, and expression levels of selected genes (HSP12, GPD1, GSH1 and TRX2). Both strains showed similar fermentative performances, and no specific cell properties and/or adaptation responses could be pointed as particularly relevant in favouring or hindering a second fermentation at very low temperatures. To better clarify this issue, further analogous studies should be performed with additional strains known or expected to exhibit higher and/or lower fermentative performances at the tested conditions.Os vinhos efervescentes, cujo exemplo clássico é o Champagne, são bastante apreciados em todo o mundo. A sua produção baseia-se numa segunda fermentação alcoólica de um vinho base (obtido a partir de uma primeira fermentação alcoólica em mosto) em recipiente fechado, invariavelmente realizada por estirpes seleccionadas da levedura Saccharomyces cerevisiae. Segundo o método clássico (méthode champenoise/traditionnelle), usado na produção de Champagne e outros vinhos efervescentes de elevada qualidade, a segunda fermentação ocorre no interior da garrafa que será disponibilizada ao consumidor final. O vinho base, suplementado com açúcar fermentável e nutrientes adicionais em quantidades apropriadas, deve inocular-se com leveduras previamente aclimatizadas. A aclimatização (“pé-de-cuba”) permite que as leveduras se adaptem e melhor tolerem as condições ambientais hostis que existem ou surgem no vinho base durante a segunda fermentação, entre as quais: teores iniciais de etanol de 8-11% v/v, que aumentam 1-1.5% durante o processo; temperaturas habitualmente inferiores a 16ºC; pressões de CO2 elevadas, atingindo 5-6 bar no final da fermentação. As leveduras para segunda fermentação encontram-se disponíveis comercialmente como culturas líquidas ou formas secas activas, estas últimas livres ou encapsuladas. As formas encapsuladas foram recentemente introduzidas no mercado e apresentam inúmeras vantagens, como a inoculação directa sem aclimatização prévia. Para a segunda fermentação, as garrafas são preferencialmente mantidas a 10-15ºC. A cinética fermentativa depende de vários factores, entre os quais a estirpe utilizada, o seu estado fisiológico aquando da inoculação, a quantidade de inóculo e as condições físico-químicas no vinho base. Uma vez concluída a fermentação, que a 11-12ºC pode demorar um mês ou mais, o vinho é envelhecido na garrafa sobre o depósito de leveduras, apenas removido no final do processo. Certas condições de segunda fermentação são particularmente adversas para as leveduras, como é o caso das temperaturas muito baixas (9-10ºC), não raramente encontradas em extensas caves subterrâneas. A estas temperaturas, mesmo uma aclimatização adequada nem sempre permite prevenir fermentações lentas ou paradas. Infelizmente, aumentar a temperatura nas referidas caves é economicamente inviável. Torna-se assim relevante analisar e compreender as alterações fisiológicas que ocorrem nas leveduras durante o processo de segunda fermentação a muito baixas temperaturas. O trabalho descrito nesta tese teve como objectivo estudar as referidas alterações. Para tal, duas estirpes de vinificação de vinhos efervescentes em forma encapsulada, denominadas 1 e 2, e dois vinhos base, designados 1 e 2, foram utilizados para segunda fermentação em garrafa (segundo o método clássico) em pequena escala, a 10ºC, em condições que mimetizaram a produção industrial. Cada estirpe foi separadamente inoculada em cada um de ambos os vinhos base, e em todas as quatro situações experimentais se realizou uma caracterização multiparamétrica das leveduras durante o processo fermentativo, de acordo com os seguintes tempos amostrais: imediatamente antes da inoculação (dia 0), e depois aos dias 1 (24 h), 2 (48 h), 12, 19, 26, 58 e 85 pós-inoculação. A referida caracterização, extensa e integrativa, focou-se em propriedades citológicas, fisiológicas e moleculares das leveduras, com o intuito de avaliar a evolução e heterogeneidade da sua vitalidade e estado adaptativo. Analisaram-se os seguintes parâmetros: viabilidade; cinética fermentativa; proteínas totais; trealose; glicogénio; lípidos neutros; e níveis de expressão relativa de genes de resposta ao stress (HSP12, GPD1, GSH1 e TRX2). A viabilidade foi estimada de dois modos: pelo método do azul de metileno (MB) e através de citometria de fluxo (FC) com um kit comercial de determinação de viabilidade (baseado em dois corantes fluorescentes). A cinética fermentativa determinou-se a partir da quantificação da glucose (com kit comercial) e glucose/frutose (realizada pela empresa Proenol, que colaborou no estudo) no vinho. As proteínas totais dosearam-se pelo método do biureto após extracção celular. A trealose, carbohidrato de reserva e importante factor de protecção contra diversos stresses, analisou-se de duas formas: a) foi extraída das células e quantificada indirectamente (quantificação absoluta, AQ), por hidrólise e quantificação da glucose resultante (com kit comercial); b) foi avaliada por FC, com utilização de um reagente fluorescente comercial. Os valores médios de fluorescência (FC) foram utilizados para comparação com os valores AQ. O coeficiente de variação robusto (RCV) das distribuições de fluorescência e as formas dos respectivos histogramas foram utilizados na análise da heterogeneidade populacional em teores de trealose. O glicogénio, principal carbohidrato de reserva, analisou-se de modo semelhante à trealose, com: a) quantificação da glucose obtida após extracção celular e hidrólise (AQ); b) estudo em FC, com utilização de acriflavina (corante fluorescente). Os lípidos neutros, utilizados na biogénese membranar e como reserva energética, foram analisados por FC, com um reagente fluorescente comercial. Os níveis de expressão relativa de HSP12, GPD1, GSH1 e TRX2 foram determinados com recurso à técnica de RT-PCR quantitativo em tempo real, utilizando o método ΔΔCT com correcção para as eficiências de amplificação. 18S (RDN18) foi aplicado na normalização dos valores de expressão. As expressões relativas foram calculadas em relação ao dia 0 (referência), separadamente para cada estirpe. HSP12 é um gene de resposta geral ao stress; GSH1 e TRX2 são considerados marcadores de stress oxidativo; GPD1 é expresso em resposta a stress hiperosmótico. A análise estatística dos resultados baseou-se em testes t de Student, análises de variância (ANOVA) com dois factores e análise de componentes principais (PCA). As duas estirpes em estudo exibiram um desempenho fermentativo muito semelhante, independentemente do vinho. As fermentações realizaram-se mais rapidamente no vinho 2 (constatou-se o seu término dia 58) do que no vinho 1 (concluídas ao dia 85). Relativamente à viabilidade celular, observou-se uma excelente correlação (r≈0.97; n=54) entre os valores obtidos por MB e FC. Dia 26, quando bastante açúcar já havia sido fermentado, ambas as estirpes possuíam ainda uma elevada viabilidade (em ambos os vinhos), que apesar de ter diminuído continuamente ao longo do processo fermentativo não o comprometeu. No que respeita às proteínas totais, constatou-se o seu aumento desde os dias 1 ou 2 até aos dias 19 ou 26, reflexo de um metabolismo activo. A sua quantidade diminuiu depois até ao dia 85, em todas as condições experimentais. Na análise da trealose, verificou-se uma ausência de correlação (r≈0.20; n=62) entre os valores de AQ e FC. De acordo com os resultados AQ, houve um aumento substancial dos teores de trealose nas primeiras 24 h, seguido de um decréscimo até às 48 h, em todos os casos. Esta ocorrência poderá traduzir uma resposta inicial ao stress causado pelo etanol. Níveis máximos de trealose (AQ) foram observados dias 19 e 26. Crê-se que a sua acumulação terá sido induzida pelas contínuas condições de stress no vinho e/ou pela necessidade de reservas de carbono/energia. Os conteúdos de trealose diminuíram depois até dia 85, particularmente em fermentações no vinho 2, revelando o seu consumo face à depleção progressiva de açúcar no meio. No estudo da trealose por FC constaram-se alterações nos valores dos RCVs ao longo do processo fermentativo em todos os casos, sugestivas de uma heterogeneidade populacional dinâmica. Adicionalmente, os histogramas das distribuições de fluorescência apresentaram-se globalmente diferentes entre estirpes. No caso do glicogénio, registou-se uma correlação fraca entre AQ e FC (r≈0.52; n=62). Teores máximos (AQ) observaram-se geralmente dia 58. Entre os dias 58 e 85, o polissacárido foi consumido em quantidades substanciais, claramente em resposta à escassez de açúcar nos vinhos. Durante o processo fermentativo, além de alterações nos RCVs (análise FC), observaram-se diferenças claras entre os histogramas de ambas as estirpes e de cada estirpe individualmente. Relativamente aos lípidos neutros, detectou-se a sua diminuição nas primeiras 48h na estirpe 1. Esta diminuição, possivelmente causada pela necessidade de reparação membranar, não foi todavia observada na estirpe 2. Nova diminuição, comum a ambas as estirpes, ocorreu entre os dias 12 e 19, provavelmente reflexo de uma reestruturação membranar (adaptativa). A acumulação verificada no final do processo, entre os dias 58 e 85, sugere que os lípidos neutros não foram utilizados como reserva energética neste período. Uma heterogeneidade populacional dinâmica foi novamente constatada, observando-se RCVs variáveis e diferenças nos histogramas ao longo do processo fermentativo (em cada estirpe e entre ambas). Quanto aos níveis de expressão relativa de HSP12, GPD1, GSH1 e TRX2, verificou-se uma redução considerável nos mesmos durante as primeiras 24 h, em todos os casos. Esta redução sugere que as leveduras já se encontravam bem adaptadas às condições de fermentação. Contudo, observou-se um aumento importante na expressão de todos os genes às 48 h (especialmente GSH1 e GPD1), de novo em todas as condições. Este aumento poderá ter sido induzido pela exposição continuada a factores de stress nos vinhos. Novos decréscimos gerais na expressão de todos os genes foram observados entre os dias 2 e 12, e também entre os dias 26 e 85, tendo os mais baixos níveis de expressão sido detectados no último tempo amostral. O último decréscimo poderá ter ocorrido por diferentes motivos, como uma diminuição na estabilidade do mRNA e/ou um comprometimento do processo de transcrição. Na PCA, a variação e separação entre amostras revelou ser bastante dependente do tempo, i.e. da progressão do processo fermentativo. No plano dos componentes principais 1 e 2 (PC1/PC2, explicativos de 83.1% da variância global), a separação entre amostras foi suportada por: a) mudanças nos teores de trealose (AQ), reflectidos em PC2; b) diminuições na viabilidade e nos açúcares fermentáveis no vinho, evidenciados em PC1. Foi possível verificar que a estirpe 2 teve um comportamento global mais semelhante em ambos os vinhos do que a estirpe 1. Uma vez que as duas estirpes apresentaram um desempenho fermentativo análogo, torna-se difícil identificar propriedades celulares ou respostas adaptativas específicas (de entre as estudadas) que possam ser particularmente relevantes no decurso da segunda fermentação a muito baixas temperaturas. Deverão realizar-se novos estudos para melhor clarificar esta questão, com recurso a estirpes com capacidades fermentativas distintas nas condições testadas. Por outro lado, parâmetros adicionais (ex.: ácidos gordos e fase do ciclo celular) deverão ser considerados em análises futuras, pela informação complementar que poderão providenciar.QREN - Programa Operacional Factores de Competitividade e Fundo Europeu de Desenvolvimento Regiona