Genomic mechanisms of gene expression regulation in the Squalius alburnoides hybrid complex

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Organismos poliplóides são organismos caracterizados pelo aumento do número de cópias genómicas. Estes funcionam como reservas de variação latente que ao se tornarem visíveis à selecção lhes confere vantagem evolutiva. A evolução das plantas deve-se grandemente a este fenómeno, uma vez que as novas combinações geram novos fenótipos e portanto rápida evolução adaptativa. Mesmo em animais, embora mais raros há casos de taxa poliplóides. Apesar disso, estes organismos estão sujeitos a uma maior instabilidade genómica, seja por aumento da carga genética de um só genoma devido à sua endoduplicação (autopoliplóides) ou por aumento desta carga através da hibridação de genomas distintos (alopoliplóides). Desta forma, para que o organismo se mantenha equilibrado a nível funcional esta instabilidade tem de ser ultrapassada. Por outro lado, tem-se verificado em plantas poliplóides que esta amplificação não é linear, ou seja, a quantidade de genoma não é proporcional à sua expressão génica. Por exemplo, foi demonstrado em milho poliplóide a existência de um efeito de dosagem na expressão génica. Actualmente sabe-se que este efeito depende grandemente da re-organização do genoma. Esta organização pode ser não só genética, mas também epigenética. Um excelente organismo para o estudo dos efeitos da poliploidização do genoma em animais é o complexo Squalius alburnoides. Esta espécie, pertencente à Família Cyprinidae, foi descrita inicialmente como tendo três diferentes ploidias no mesmo complexo: diplóide, triplóide e tetraplóide. Actualmente sabe-se que este complexo tem uma origem híbrida resultante de um cruzamento entre um ancestral materno de S. pyrenaicus (genoma P) e de um ancestral paterno semelhante ao actual Anaecypris hispanica (genoma A). S. alburnoides encontra-se actualmente distribuído por toda a Península Ibérica. Em Portugal, a distribuição do complexo ocorre nos rios de Norte ao Sul do país, mas enquanto no Sul há incorporação do genoma P por interacção com a espécie Squalius pyrenaicus, no Norte o complexo incorpora o genoma C, uma vez que interage com a espécie Squalius carolitertii. Esta incorporação resulta das diferentes formas de reprodução do complexo que dão origem a diferentes combinações de genomas e ploidias. Em vertebrados, Pala et al., (2008) descobriu pela primeira vez que nas formas triplóides do complexo S. alburnoides existia silenciamento génico em alguns alelos envolvendo também um mecanismo de compensação de dose na expressão génica de alguns dos genes investigados. Consequentemente colocou-se a questão se o silenciamento seria num haploma inteiro ou não. Observou-se que nos indivíduos híbridos triplóides havia contribuição diferencial de genomas, ou seja, em diferentes genes verificou-se a ocorrência de duas situações diferentes: exclusiva expressão do genoma A ou expressão bialélica (PA). Não havendo portanto silenciamento de uma cópia de genoma inteira. Adicionalmente, ao comparar vários genes diferentes percebeu-se que havia preferência para o silenciamento das cópias de genoma P, verificando-se que o silenciamento não ocorria completamente ao acaso. É possível que nos híbridos de S. alburnoides este mecanismo actue de forma plástica, podendo haver alelos que escapem aos vários mecanismos de regulação. De uma forma geral, em S. alburnoides os constrangimentos genéticos em poliplóides são ultrapassados mimetizando um contexto diplóide. No entanto, permanecem desconhecidos que mecanismos estão subjacentes à regulação da expressão e ao silenciamento diferencial dos alelos. Em plantas, já foram estudados variados processos de regulação génica. Entre estes encontramse a metilação ao nível do DNA e modificação das histonas que dependendo da sua localização desempenham um importante papel na regulação da estrutura da cromatina. A metilação envolve modificações covalentes no material genético das células. Eucariotas superiores possuem este mecanismo de regulação que actua adicionando um grupo metil às citosinas dos dinucleótidos CG, com a finalidade de impedir a transcrição. Uma vez adquirido um determinado padrão de metilação, os tecidos mantêm-no nas suas células ao longo de vários ciclos celulares devido à actividade da metiltransferase que metila as novas cadeias de DNA sintetizadas. Inclusive, pelo menos em plantas, sabe-se que esse padrão pode atravessar diversas gerações. Estudos anteriores mostram uma relação entre plantas alotetraplóides, tanto sintéticas como naturais, e modificações por metilação no genoma. Por outro lado, diversos estudos evidenciam que, embora bastante conservados, os microRNAs variam a sua expressão mesmo em espécies próximas. Além disso, mostrou-se estarem envolvidos nas variações da regulação génica de plantas alopoliploides, não havendo expressão aditiva. Os small RNAs foram inicialmente identificados em Caenorhabditis elegans e fazem parte de uma classe de RNAs não codificantes tendo normalmente ≈22 nucleótidos de comprimento. Actualmente, já estão descritos diversos tipos de RNA não codificantes para além dos microRNA que possuem também uma função regulatória. Embora estas classificações ainda sejam relativamente recentes, pode-se afirmar com clareza que ambos os miRNAs e os siRNAs (também designados por tasiRNAs) são processados pelo mesmo complexo com o intuito de regular o silenciamento génico. Desta forma, o produto final da sua biogénese é responsável tanto pela degradação do transcrito como pela repressão de tradução. Assim, poderemos questionar se nos organismos poliplóides, este ou outro tipo de RNAs não codificantes, poderão estar a controlar a expressão génica de forma a permitir a este tipo de organismos superar a instabilidade causada pelo aumento da dose génica, ou até pela junção de dois genomas diferentes. Tendo em conta os mecanismos já descritos em plantas, torna-se imperativo tentar perceber de que forma estes terão igualmente um papel decisivo na regulação génica que ocorre em vertebrados, mais especificamente no complexo Squalius alburnoides. Para tal, usaram-se indivíduos AA, PA e PAA do complexo e ainda PPs que foram analisados para esclarecer duas possibilidades: a regulação por microRNAs e a regulação por metilação de DNA. Enquanto que o primeiro requereu uma análise através de Sequenciação de Nova Geração e microarrays, a segunda abordagem usou endonucleases com diferentes sensibilidades à metilação e um ensaio imunológico com afinidade para DNA metilado. Após um extensivo controlo de qualidade das bibliotecas sequenciadas, verificou-se que S. pyrenaicus possuía um perfil de expressão mais distante do que os indivíduos pertencentes ao complexo e que estes últimos possuíam os seus miRNA mais expressos do que PP, o que seria de esperar visto fazerem parte de um complexo alopoliplóide, necessitando portanto de maior regulação. A técnica de hibridação em microarrays revelou ter um padrão de expressão bastante semelhante ao obtido nos dados da sequenciação, apesar do seu elevado background e do facto da análise individual da expressão de miRNAs na maioria dos casos não se mostrar reprodutível com os resultados obtidos através da sequenciação. Além disso encontraram-se ainda sequências de 33 nucleótidos mais expressas em triplóides (PAA) provavelmente sendo algum tipo de smallRNA ainda não identificado, mas que poderá ter um papel importante da compensação de dosagem. Por outro lado, a metilação de DNA mostrou ser significativamente diferente e elevada nos indivíduos triplóides em comparação aos outros indivíduos analisados do complexo. Adicionalmente, verificou-se o expectável para as diferenças nos níveis de metilação de DNA entre órgãos tendo em conta a diversidade de genes a serem expressos em cada caso, sendo o fígado o tecido menos metilado e as células sanguíneas o mais metilado. No geral, os resultados deste estudos apontam para a existência de um mecanismo regulatório pré-transcricional por metilação de DNA nas formas triplóides, ao invés de um controlo póstranscricional massivo. De uma perspectiva evolutiva, não faz sentido transcrever genes que irão depois ser regulados por um qualquer mecanismo pós-transcricional. Tendo isto em conta, faz sentido que os triplóides PAA regulem a sua expressão génica de forma a obterem uma expressão semelhante à de um diplóide, preferencialmente através do mecanismo de metilação de genoma e usando apenas os miRNA para pequenos ajustes de expressão dirigidos a específicos transcritos alvo.The cyprinidae Squalius alburnoides is an allopolyploid complex that inhabits the Iberian Peninsula rivers. Its hybrid origin and the vast variety of reproductive mechanisms generate different genomic compositions, including diploids (AA, PA) and triploids (PAA) forms. Using S. alburnoides as her model, Pala et al. (2008) showed for the first time in vertebrates that, as a response to the increase in the genome dosage, triploids could regulate gene expression to a diploid state. Besides, several alleles were showed to be silenced in the triploids. However until now, the mechanism of gene regulation was not described. Previous studies in plants demonstrate that silencing in allopolyploids could be explained by several epigenetic mechanisms. For instance, DNA methylation plays a major role in the chromatin remodelling and microRNAs seem to regulate gene expression post-trasncriptionaly. Therefore, in order to find out if these mechanisms have an important function in the regulation of gene expression in the S. alburnoides allopolyploid complex, they were investigated. MicroRNAs profiles were analysed by next generation sequencing and microarray hybridization while genomic DNA methylation was analysed by an immunoassay protocol and using methyl sensitive restriction analyses. Thus, results showed that the post-transcriptional regulation by non-coding microRNAs does not seem to play a major role in gene expression regulation of the complex. On the contrary, this regulation seemed to be mainly accomplished by the pretranscriptional mechanism of DNA methylation since this work demonstrated that it is predominant in the complex, mainly in the triploid form PAA. Thus, methylation should function as a primary step of regulation in order to buffer the polyploidy effect and, only then, microRNAs should be used as a tool to fine-tuning the allopolyploid expression of some essential genes is particular