Streptococcus agalactiae causing human infections : genetic diversity and capsular switching

Tese de doutoramento, Ciências e Tecnologias da Saúde (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2011Streptococcus agalactiae (group B streptococci, GBS) is primarily a colonizing agent of the genitourinary and gastrointestinal tracts of a significant proportion of the human population. It is, however, well established as a leading cause of bacterial sepsis and meningitis in neonates and is increasingly associated with invasive infections in adults. While vertical transmission is commonly accepted to be the cause of early-onset disease, the source of bacterial strains causing infection in the late-onset period is less well understood. Administration of intrapartum antimicrobial prophylaxis to colonized women has resulted in a striking decline in early-onset and maternal GBS disease, but late-onset infections have mostly remained unchanged. Moreover, antimicrobial prophylaxis raised concerns as to selection and emergence of GBS resistant strains and alternative prevention strategies have focused on the development of vaccines that hold promising, although still preliminary results. The aim of the work presented in this thesis was to characterize the population structure of GBS in Portugal, and to assess the genetic diversity of isolates recovered from vaginal colonization and invasive disease in different age groups, to contribute to the global epidemiology of GBS and our understanding of GBS population biology. To this end a set of common techniques was chosen, including serotyping, antimicrobial susceptibility testing, pulsed field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST) and surface protein gene profiling. In combination, these methods allowed the identification of the main genetic lineages circulating in Portugal and Barcelona, providing the means for an appropriate comparison of both. These studies started with the comparison of 64 isolates recovered from invasive infections in newborns in the Lisbon area with 269 isolates colonizing women in the third trimester of pregnancy, from the same period. The genetic lineages defined by both PFGE and MLST identified very diverse populations with reported differences in the prevalence of serotypes and clones in carriage and invasive disease. A major finding concerned the identification of an unusually high proportion of ST24 isolates among serotype Ia, further strengthened by the independent study of another population (212 neonatal isolates) from the Barcelona area. Despite the geographic distance, both studies from Barcelona and Lisbon revealed extensive similarity in terms of clonal structure and genetic lineages. The high prevalence in both the studies of a particular lineage serotype Ia, defined by ST24 and the surface protein gene bca, highlighted the importance of local dynamics, indicating that genetic evolution of GBS presents with a geographic structure and may depend on local factors. The subsequent analysis of 225 isolates recovered from non-pregnant adults in Portugal revealed a GBS population dominated by a more diverse clonal composition when compared to that of neonates, consistent with the broader spectrum of disease presentation in these patients and consequent multiplicity of genetic lineages. Invasive disease in this population increased with age and was more frequent among men. The dominance of serotype Ia in this population, regardless of age, highlighted the importance of this serotype in GBS pathogenesis as a leading cause of invasive infections in adults, not reported elsewhere but already noted among neonatal infections in the Iberian Peninsula. Furthermore, the high prevalence of ST24 in all these studies, as opposed to rare descriptions elsewhere, suggested that this lineage had enhanced invasiveness and was probably expanding as a regionally successful clone that may disseminate more globally. Macrolide resistance rates in Portugal did not show significant trends, even if macrolides have been used in intrapartum prophylaxis increasing the selective pressure on GBS. Macrolide resistance is disseminated in Portugal by both a multiclonal mechanism resulting from the spread of resistance genes throughout most serotypes and genetic backgrounds, as well as by clonal expansion of particular lineages, such as the serotype V ST1/alp3. One of the main purposes of the analysis of a significant number of GBS isolates was their classification into lineages sharing the same genetic background, which would allow the inference of genetic relationships between strains and their contextualization in the global epidemiology of GBS. However, the associations of phenotype-genotype or between different genetic traits were never absolute, highlighting the role of horizontal genetic transfer in the evolution of GBS. Capsular switching was anticipated to occur frequently within GBS, even though this species is not recognized to be naturally competent for the acquisition of foreign DNA. Substantial evidence provided by the epidemiological studies performed on the Portuguese GBS collections drove the search for capsular transformants within these populations. The results obtained confirmed the existence of capsular switching in GBS, but questioned the high frequency of these events estimated from previous studies. Serotyping errors probably justified the overrepresentation of capsular switching in epidemiological studies. The mechanism for these genetic transfer events involved the replacement of the whole capsular locus instead of the previously proposed genetic transfer of only the serotypespecific genes. Globally, the results presented in this thesis suggest that GBS has an apparent remarkably stable, both temporally and geographically, clonal structure. Against this, background diversification is ongoing and can depend on local factors. Capsular switching is likely contributing to diversification, however not as frequently as initially thought and may impact on the vaccine formulations currently under development. Despite increasing information on maternal colonization and invasive disease, a better understanding of colonization in adults and natural reservoirs of GBS is required for the appropriate management of the GBS infections.Streptococcus agalactiae (estreptococos do grupo B, GBS) é maioritariamente um agente colonizador dos tratos genito-urinário e gastrointestinal de uma proporção significativa da população humana. É, no entanto, reconhecido como uma das principais causas de sépsis e meningite bacteriana em recém-nascidos, e crescentemente associado a infecções invasivas em adultos. Enquanto a transmissão vertical é normalmente aceite como causa do aparecimento precoce da doença, a origem das estirpes bacterianas que causam infecção no período tardio é menos bem compreendida. A administração de profilaxia antimicrobiana intraparto a mulheres colonizadas resultou num declínio acentuado das infecções por GBS de início precoce e materna, mas as infecções de início tardio, na sua maioria, mantiveram-se inalteradas. Mais ainda, a profilaxia antimicrobiana levantou preocupações quanto à selecção e ao aparecimento de estirpes de GBS resistentes e as estratégias alternativas de prevenção têm-se focado no desenvolvimento de vacinas com resultados promissores, embora ainda preliminares. O objectivo do trabalho apresentado nesta tese foi caracterizar a estrutura da população de GBS em Portugal e avaliar a diversidade genética das estirpes isoladas de colonização vaginal e doença invasiva em diferentes faixas etárias, de forma a contribuir para a epidemiologia global de GBS e para a compreensão da biologia populacional de GBS. Para atingir esse objectivo foi escolhido um conjunto de técnicas, incluindo a serotipagem, testes de susceptibilidade a antimicrobianos, electroforese em gel de campo pulsado (PFGE), “multilocus sequence typing” (MLST) e determinação de perfis de proteínas de superfície. Em combinação, estes métodos permitiram a identificação das principais linhagens genéticas que circulam em Portugal e Barcelona, fornecendo meios para uma comparação apropriada de ambas. Estes estudos começaram com a comparação de 64 estirpes isoladas de infecções invasivas em recém-nascidos na região de Lisboa com 269 estirpes de colonização em mulheres no terceiro trimestre de gravidez, no mesmo período. As linhagens genéticas definidas por PFGE e MLST identificaram populações muito diversificadas, com diferenças descritas na prevalência dos serótipos e clones, em colonização e doença invasiva. Uma constatação importante diz respeito à identificação de um número excepcionalmente elevado de estirpes ST24 no serótipo Ia, reforçado pelo estudo independente de outra população (212 estirpes neonatais) da área de Barcelona. Apesar da distância geográfica, ambos os estudos de Barcelona e Lisboa revelaram uma enorme semelhança em termos da estrutura clonal e linhagens genéticas. A elevada prevalência em ambos os estudos de uma linhagem particular do serótipo Ia, definida pelo ST24 e pelo gene que codifica a proteína de superfície bca, salientaram a importância de dinâmicas locais, indicando que a evolução genética de GBS apresenta uma estrutura geográfica e pode depender de factores locais A análise subsequente de 225 estirpes isoladas de adultos, exceptuando grávidas, em Portugal revelou uma população de GBS dominada por uma composição clonal mais diversificada quando comparada com a de recém-nascidos, consistente com o espectro mais alargado de manifestações de doença nestes indivíduos e consequente multiplicidade de linhagens genéticas. A doença invasiva nesta população aumentou com a idade, sendo mais frequente entre os homens. A predominância do serótipo Ia nessa população, independentemente da idade, destacou a importância deste serótipo na patogénese da GBS como uma das principais causas de infecções invasivas em adultos, não relatada noutros locais mas já identificada nas infecções neonatais na Península Ibérica. Além disso, a elevada prevalência de ST24 em todos estes estudos, por oposição a raras descrições noutros locais, sugerem que esta linhagem tem maior capacidade invasiva e está provavelmente em expansão como um clone bem-sucedido a nível regional que pode disseminar mais globalmente. As taxas de resistência aos macrólidos em Portugal não apresentaram tendências significativas, ainda que os macrólidos sejam usados na profilaxia intraparto, aumentando a pressão selectiva sobre GBS. A resistência aos macrólidos está disseminada em Portugal, tanto por um mecanismo multiclonal que resulta na dispersão de genes de resistência na maior parte serótipos e clones, como pela expansão clonal de linhagens específicas, tais como a do serótipo V ST1/alp3. Um dos principais objectivos da análise de um número significativo de estirpes de GBS era a sua classificação em linhagens com o mesmo património genético, o que permitiria a inferência de relações genéticas entre estirpes, e a sua contextualização na epidemiologia global de GBS. Contudo, as associações fenótipo-genótipo ou entre características genéticas diferentes nunca foram absolutas, salientando o papel da transferência genética horizontal na evolução de GBS. Foi proposto que a transformação capsular ocorre frequentemente em GBS, apesar de esta espécie não ser reconhecida como naturalmente competente para a aquisição de DNA exógeno. Evidências substanciais fornecidas pelos estudos epidemiológicos realizados nas colecções portuguesas de GBS levaram à pesquisa de transformantes capsular nessas populações. Os resultados obtidos confirmaram a existência de transformação capsular em GBS, mas questionaram a elevada frequência destes eventos, estimada em estudos anteriores. Erros de serotipagem provavelmente justificam a elevada representação de transformação capsular em estudos epidemiológicos. O mecanismo na base destes eventos de transferência genética envolveu a substituição de todo o locus capsular em vez da transferência genética de apenas os genes específicos do serótipo, proposta anteriormente. Globalmente, os resultados apresentados nesta tese sugerem que os GBS possuem uma estrutura clonal, extremamente estável, tanto geográfica como temporalmente. Por oposição, a diversificação do património genético é permanente e pode depender de factores locais. A transformação capsular provavelmente contribui para esta diversificação, porém não tão frequentemente quanto inicialmente se pensava e pode ter um impacto na formulação das vacinas actualmente em desenvolvimento. Apesar do aumento da informação sobre a colonização materna e a doença invasiva, uma melhor compreensão da colonização em adultos e dos reservatórios naturais de GBS é necessária para uma abordagem mais fundamentada das infecções por GBS.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/41761/2007) e programa POPH/FS