Adenosine A2A receptors in the rat hippocampus: stress related changes

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009O stresse modula a função cerebral e a cognição. Situações de stresse excessivo podem induzir alterações morfológicas e funcionais no cérebro com consequências cognitivas. Estudos clínicos têm vindo a demonstrar que o stresse pode estar relacionado com uma vulnerabilidade aumentada para sofrer de desordens psiquiátricas como a depressão e a ansiedade. Os modelos de stresse que melhor parecem reproduzir o que se observa clinicamente são aqueles em que este é induzido durante a infância, num período de grande desenvolvimento neuronal. Os estudos publicados indicam que eventos traumáticos ocorridos no período pós-natal têm um efeito permanente no cérebro. Um dos modelos mais aceites e utilizados pela comunidade científica como paradigma de stresse crónico no adulto consiste na perturbação da relação mãe-filho, em animais de laboratório, denominado de separação maternal. A aplicação deste protocolo resulta em níveis plasmáticos de corticosterona permanentemente elevados bem como em alterações no sistema nervoso central. Uma das estruturas cerebrais mais sensíveis ao stresse é o hipocampo, área cerebral crucial na aprendizagem e memória. A adenosina é um importante neuromodulador da excitabilidade neuronal do hipocampo tendo acções importantes, não só na transmissão basal, mas também na plasticidade sináptica. Os seus efeitos são mediados principalmente por dois receptores, os receptores A1, com acções principalmente inibitórias e presentes em grande densidade; e os receptores A2A, com acções maioritariamente excitatórias e que apresentam baixos níveis de expressão nesta área cerebral. Alterações na densidade destes receptores foram observadas em diversas condições, como actividade convulsiva, em modelos de doenças neurodegenerativas ou mesmo como consequência do envelhecimento. A alteração nos níveis dos receptores da adenosina tem consequências na sua acção neuromoduladora interferindo com a normal regulação da excitabilidade neuronal. O objectivo do presente trabalho foi o de avaliar, na idade adulta, o efeito de um stresse crónico, induzido logo após o nascimento, nos receptores de adenosina. Foram também avaliadas diversas proteínas intervenientes em processos de plasticidade e memória que podem estar envolvidas no aumento da susceptibilidade do hipocampo como consequência do stress. Ratos machos da estirpe Wistar foram divididos em dois grupos, controlo (CTR) e separação maternal (MS-Maternal Separation). O grupo MS foi separado da mãe diariamente, do dia 2 ao dia 14 de idade, durante 3 horas, enquanto o grupo controlo permaneceu não manipulado. Entre as 6 e as 8 semanas de idade, os animais foram sacrificados e várias áreas cerebrais (hipocampo, córtex e estriado) utilizadas para ensaios de ligação e Western Blotting. Os níveis dos receptores A1 e A2A de adenosina foram quantificados por ensaios de ligação utilizando antagonistas selectivos para os receptores de adenosina do subtipo A1 (DPCPX, 0- 10 nM) e A2A (ZM 241385, 0-10nM) ou por Western Blotting nas várias áreas cerebrais. A separação maternal induziu, no hipocampo, um aumento de 56,2±9,4 % (n=3; p<0,05) nos níveis de receptores do subtipo A2A , obtido por Western Blotting e uma diminuição de 1202±68 fmol/mg (n=4) para 1073±48 fmol/mg (n=4) dos receptores do subtipo A1. Nas restantes áreas cerebrais não foram observadas diferenças nos níveis destes receptores. As alterações induzidas pelo stress nos níveis dos receptores de adenosina seguem a mesma tendência daquelas que ocorrem com o envelhecimento, onde foi observada uma alteração na interacção entre estes receptores. Com o objectivo de estudar a interacção A1/A2A em condições de stress realizaram-se curvas de deslocamento, na presença e ausência de um agonista selectivo para os receptores do subtipo A2A (CGS 21680 – 30nM). Estas curvas foram realizadas promovendo o deslocamento da DPCPX (2 nM) um antagonista selectivo dos receptores do subtipo A1 pela CPA (0-6 μM) um agonista selectivo dos mesmos receptores. Não foram observadas alterações a este perfil de deslocamento entre animais CTR e MS, na presença ou ausência de CGS 21680. A localização regional dos efeitos do stresse nos níveis dos receptores de adenosina, com impacto predominante no hipocampo, conduziu à quantificação dos níveis dos receptores de glucocorticoides e mineralocorticoides nas várias áreas cerebrais por Western Blotting. Estes são os receptores citoplasmáticos para a corticosterona e são fundamentais na mediação da resposta ao stress. Têm ambos uma expressão elevada no hipocampo e alterações na sua razão (MR/GR) implicam alterações nas propriedades neuronais e em fenómenos de plasticidade e memória. A separação maternal induziu, em todas as áreas cerebrais estudadas, uma diminuição nos níveis dos receptores de glucocorticoides sem modificações nos níveis dos receptores de mineralocorticoides. Estas alterações tiveram maior impacto no hipocampo (26,1±4,5% ;P<0,05; n=3) comparando com o córtex (16,3 ±3,4%; P<0,05; n=4) ou o estriado (9,6 ± 2,6%; P<0,05; n=4). Com o objectivo de explorar o potencial impacto destas alterações na função do hipocampo, foram avaliadas várias proteínas envolvidas na transmissão sináptica ou em processos de plasticidade. Foram investigadas alterações nos níveis da subunidade 1 do receptor AMPA para o glutamato (GluR1), da subunidade β3 do receptor GABAA (β3-GABAA), do receptor TrkB, do factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), e do receptor 1 da hormona de libertação da corticotrofina (CRH-R1). A separação maternal induziu alterações nos níveis de todas estas proteínas no hipocampo. Observa-se uma diminuição dos níveis de GluR1 (25%±5%; P<0,05;n=3), de β3-GABAA (16±2%; P<0,05; n=3) e dos receptores TrkB (17±2,3%; n=3;P<0,05) e um aumento de DBNF (67±13%; n=4; P<0,05) e do CRH-R1 (55±7%; P<0,05; n=3). Estas alterações mostram que o stress crónico numa fase precoce da vida, induz modificações permanentes no cérebro, principalmente no hipocampo que envolvem tanto a transmissão inibitória como excitatória. Os receptores GABAA são os receptores ionótropicos do principal neurotransmissor inibitório do sistema nervoso central e a diminuição dos níveis da subunidade β3 deste receptor pode traduzir-se em alterações permanentes na neurotransmissão inibitória. Por outro lado, tanto a inserção de receptores AMPA contendo a subunidade GluR1 como a expressão dos receptores TrkB são importantes na indução da potenciação de longa duração (LTP). As alterações observadas nos níveis destes receptores poderão justificar a diminuição da LTP já observada em animais submetidos a separação maternal. Com o objectivo de avaliar se todas estas alterações ocorriam em paralelo com modificações na densidade sináptica utilizou-se a sinaptofisina como marcador sináptico e avaliaram-se, por Western Blotting, alterações nos níveis desta proteína entre animais CTR e MS. Não se observaram alterações na densidade sináptica, detectáveis pela técnica utilizada. Assim, este trabalho vem mostrar que a indução de stresse num período de grande desenvolvimento neuronal se traduz em alterações permanentes no cérebro, detectáveis na idade adulta, com especial impacto no hipocampo. Estas alterações envolvem várias proteínas intervenientes não só na transmissão sináptica basal mas também em fenómenos de plasticidade, tendo consequentemente implicações funcionais na memória. Mostra-se ainda, pela primeira vez, que num modelo de stress crónico usado no estudo de psicopatologias, os receptores da adenosina estão alterados. O facto de estas alterações seguirem um padrão semelhante ao que aconece no envelhecimento sugere que o stress pode aumentar a susceptibilidade do hipocampo não apenas para futuros insultos, mas pode também exacerbar os défices cognitivos que acompanham o próprio envelhecimento Estes resultados suportam ainda a utilização de antagonistas selectivos dos receptores A2A, que têm sido propostos como antidepressivos em outros modelos.Stress induced early in life interferes with the establishment, maintenance and development of neuronal networks. Some of these changes share similarities with those observed in aging. An imbalance in the density of the adenosine A1 and A2A receptors in the hippocampus and striatum of aged animals, was previously reported. We now investigated if the induction of chronic stress, through maternal separation, could have a similar impact on adenosine receptors and related proteins in the hippocampus, striatum and cortex. Male Wistar rats were assigned to either control (CTR) or maternal separated (MS) group. The MS were separated from their mothers for 3h/day (2-14 postnatal days) while CTR were left undisturbed. At 7-8 weeks of age they were sacrificed, the hippocampi and striata dissected and processed. Saturation binding curves with the selective antagonist for A1 receptors, [3H]DPCPX (0-7 nM) or the selective antagonist for A2A receptors, [3H]ZM 241385 (0-7 nM) were performed. The displacement of [3H]DPCPX (2 nM) by the selective A1 receptor agonist, CPA (0-6 μM) in the presence of the selective A2A receptor agonist, CGS 21680 (30 nM) was assessed. The levels of A1 and A2A receptors, GR and MR, GABAA-β3, GluR1, CRH-R1, TrkB and synaptophysin were quantified by immunoblot analysis. The hippocampus was the only area with changes in the levels of adenosine receptors. A2A receptors were found to be increased by 56.2±9.4 % (n=3; P<0.05) and A1 slightly decreased (1202±68 fmol/mg (n=4) to 1073±48 fmol/mg (n=4)) in MS compared to CTR animals. These changes were not accompanied by alterations in the affinity pattern of A1 receptors induced by activation of A2A receptors. A region specific effect was further confirmed by observing that the MR/GR ratio was decreased more markedly in the hippocampus of MS animals than in other brain areas. A decrease of 26.1±4.5 % (n=3, P<0.05) in the levels of GR was observed in the hippocampus compared to a decrease of 16.3±3.4 % (n=4, P<0.05) in cortex and of 9.6±2.6 % (n=4, P<0.05) in striatum. MS had also an impact in hippocampal markers of synaptic plasticity. GluR1 subunit, GABAA-β3 and TrkB receptors were decreased (n=3, P<0.05) while BDNF and CRH-R1 were increased (n=3-4, P