Mesenchymal stem cells for the cell-based therapy of type 1 diabetes : an experimental approach

Tese de doutoramento, Medicina (Fisiopatologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2011Human adult mesenchymal stem cells (hMSC) represent a potential source for cellbased therapies in Diabetes Mellitus. Yet, till now, no definitive data exist for clinical application. Aims 1. Evaluation of the pancreatic endocrine differentiation potential of humanmesenchymal stem-cells, immortalized with telomerase (hMSC-TERT); 2. Comparative analysis of the plasticity and molecular signature of human-islet-derived pancreatic cells (hIPC) and bone-marrow-derived hMSC (hBM-MSC). Research strategies: 1. In vitro differentiation of hMSC-TERT into insulin producing cells through: a) Endocrine-promoting culture conditions; b) Ectopic expression of two key regulatory genes of human endocrine pancreas, neurogenin3 (hNGN3) and pancreatic-duodenal homeobox 1 (/hPDX-1) genes in hMSC-TERT. 2. Comparison of the functional signature of hIPC and hBM-MSC by: a) Immunophenotype characterization; b) In vitro mesenchymal and endocrine differentiation of primary hBM-MSC and hIPC; c) Transcriptome analysis for detection of mesenchymal and adult stem-cell related gene markers. Identification of target genes, related to the origin and function of hBM-MSC and hIPC. Results We could demonstrate that hMSC-TERT can be differentiated in vitro into pancreatic endocrine phenotypes with the ability to synthesise and store insulin. Similar to pancreatic development, in hMSC-TERT, NGN3 contributes to the activation of PDX-1 promoter. Insulin secretion in a glucose-sensing manner was not detected in our cell system, which indicates that a mature state of beta-cell was not attained in these phenotypes; hIPC and hBM-MSC display very similar MSC phenotypes. However, our data suggest distinct functions of these populations, which are related to a “mesodermal tissue specification” and “positional memory” of these cells. In hIPC, we confirmed a state of epithelial-mesenchymal transition. Conclusions MSC populations are adult stem cells with distinct levels of plasticity and commitment. Future studies will help to identify those MSC populations with greater potential to replace or regenerate beta cells in type 1 Diabetes.As células estaminais adultas obtidas a partir do estroma de tecidos humanos, representam uma fonte celular potencialmente atractiva para a terapia celular da Diabetes Mellitus. Todavia, não existem ainda resultados definitivos que permitam a sua aplicação clínica. Objectivos 1. Avaliação do potencial de diferenciação endócrina das células estaminais mesenquimatosas humanas, imortalizadas pela telomerase (hMSC-TERT); 2. Análise comparativa da plasticidade e assinatura molecular de células humanas derivadas do ilhéu pancreático (hIPC) e células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea (hBM-MSC). Estratégias de investigação 1. Diferenciar in vitro as hMSC-TERT em células produtoras de insulina através de: a) Cultura em meio específico pró-endócrino; b) Expressão ectópica de dois genes reguladores do pâncreas endócrino humano, neurogenina3 (hNGN3) e pancreatic-duodenal homeobox 1 (hPDX-1) nas células hMSC-TERT. 2. Comparar a assinatura molecular funcional das hIPC e hBM-MSC por: a) Caracterização do fenotipo imunológico; b) Diferenciação in vitro das hIPC e hBM-MSC em linhagens mesenquimatosas e endócrinas; c) Análise transcripcional de marcadores do mesênquima e genes associados ao carácter estaminal. Identificação de genes-alvo relacionados com a origem e função das hIPC e hBM-MSC. Resultados As hMSC-TERT são diferenciáveis em fenótipos do pâncreas endócrino com capacidade de síntese de insulina. Tal como ocorre na pancreatogénese, a expressão de NGN3 contribui para a activação do PDX1 nas hMSC-TERT. A ausência de resposta insulínica à glicose indica que as hMSC-TERT modificadas não atingiram a maturidade funcional de células-beta nativas; As hIPC e hBM-MSC apresentam características de MSC, tendo todavia, funções tecidulares distintas que reflectem diferenças moleculares relacionadas com a “especificidade mesodérmica” e “memória posicional” destas células. As hIPC, encontram-se num estado de transição epitelial-mesenquimatosa . Conclusões As populações MSC, são células estaminais adultas com níveis distintos de plasticidade e compromisso tecidular. Estudos futuros permitirão identificar as MSC com maior potencial para substituição ou regeneração de células beta na Diabetes tipo 1