Molecular epidemiology of Streptococcus pneumoniae : impact of PCV7 in the Pneumococcal population responsible for invasive pediatric infections

Tese de doutoramento, Ciências e Tecnologias da Saúde (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2011Streptococcus pneumoniae is considered to be one of the major pathogens worldwide in the pediatric care setting. A variety of antimicrobial agents is used to treat pneumococcal infections, but the recent increase and worldwide dissemination of strains resistant to the main antimicrobials used, namely -lactams and macrolides, is difficulting the treatment of infections. With the purpose of reducing the burden of invasive pneumococcal disease (IPD) and the dissemination of resistant strains, a seven-valent conjugate vaccine (PCV7), containing the polysaccharides of the seven most prevalent serotypes in the USA, was licensed first in USA and then in other countries. The efficacy of this vaccine has been demonstrated in the USA, but due to significant variations in terms of prevalence of infection, serotype distribution and antimicrobial resistance, the usefulness of this vaccine in other countries is compromised. The aim of this work was to evaluate the potential impact of PCV7 in Portugal, which has been administered since late 2001 through the private sector. In order to achieve this, a collection of 475 S. pneumoniae isolates recovered between 2003 and 2008, from invasive infection in children and adolescents (<18 yrs), was characterized by serotyping, antimicrobial susceptibility testing, pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and multi-locus sequence typing (MLST). The data was then compared with previous studies in order to infer the possible changes in the pneumococcal population after vaccine availability. The results obtained in this study revealed a significant reduction of the overall proportion of IPD caused by serotypes covered by PCV7. Yet this decrease was accompanied by an increase of non-vaccine serotypes such as serotypes 1, 19A and 7F. Due to the considerable variation in terms of genetic lineages within the same serotype it was important to determine which clones were associated with the expansion of these non-vaccine types. Furthermore, it was essential to establish if the lineages identified in the post-vaccine period were genetically related to the pre-vaccine clones. Overall, the molecular typing of the invasive isolates demonstrated that the clones identified in the emerging serotypes were already in circulation before vaccine availability. One of the main serotypes associated with IPD and antimicrobial resistance after PCV7 availability was serotype 19A. This serotype became increasingly important in several countries but the different studies performed in several geographic regions indicated that the genetic lineages associated with its expansion were unrelated. While in Portugal, the main lineage in expansion was represented by the clone Denmark14-ST230, the one found increasing in the USA was represented by ST320 and ST199. To determine if the clone increasing in Portugal was restricted to the invasive population we performed a study concerning all serotype 19A strains recovered from IPD, non-invasive infections and asymptomatic carriers between 2001 and 2006 in Portugal. Indeed, certain lineages were found to be more associated with carriage (ST1151 and ST416) while others were associated with invasive disease (ST193) but the main lineage associated with 19A expansion, represented by ST230, was found in all three populations. PCV7, along with the more recent vaccines PCV10 and PCV13, cover a restricted number of serotypes, and taking into consideration that the introduction of the first pneumococcal conjugate vaccine led to the increase of non-vaccine serotypes, the need for new, non-serotype based, vaccines persists. Several proteins have already been proposed but none of them seem to improve the coverage of the already available vaccines. Nevertheless, a recently discovered set of proteins, which compose pilus-like structures, were suggested to be used in a new vaccine formulation. To evaluate the potential use of pili in vaccine and to determine their possible role as virulence factors in S. pneumoniae, we determined the prevalence of the two known pili (PI-1 and PI-2) in a collection of invasive isolates recovered from children and adolescents (<18 years) between 1999 and 2008. Overall, only 17% of the invasive pneumococcal strains presented PI-1 while PI-2 was found in 33% of the population. An association between pili and serotype and PFGE clone was identified yet, all piliated strains presented one of the capsular types covered by the recent PCV13. Since only a small proportion of invasive pneumococcal strains presented pili and because all piliated pneumococci harbored capsular types covered by the most recent conjugate vaccines we consider that pili-based vaccines might not be the appropriate choice for prevention of pneumococcal infection. The results obtained in this study indicate that the pneumococcal population has an extraordinary ability to adapt to stressful situations, such as the introduction of a vaccine, due to the extensive diversity of capsular types and genetic lineages found worldwide. Furthermore, taking into consideration the changes observed after PCV7, the new conjugate vaccines will most probably face the same problem which enhances the need for continuous surveillance of IPD.Streptococcus pneumoniae é considerado um dos principais agentes patogénicos em infecções pediátricas a nível mundial. Apesar de existir uma variedade de antibióticos para o tratamento das infecções pneumocócicas, o recente aumento dos níveis de resistência e a disseminação internacional de estirpes resistentes aos principais antibióticos utilizados na terapêutica, nomeadamente beta-lactâmicos e macrólidos, têm dificultado o tratamento destas infecções. Com o intuito de reduzir a incidência da infecção pneumocócica invasiva e de estirpes resistentes aos antibióticos, foi licenciada uma vacina pneumocócica conjugada (PCV7). Esta vacina, inicialmente introduzida nos Estados Unidos da América (EUA) e posteriormente em outros países, encontra-se direccionada para os sete serotipos mais prevalentes em infecção invasiva e com os níveis mais elevados de resistência aos antimicrobianos, nos EUA. A eficácia desta vacina foi já comprovada nos EUA, porém variações da distribuição e prevalência dos serotipos em termos geográficos têm questionado a sua eficácia noutros países. O objectivo do presente trabalho consistiu na aferição do potencial impacto da PCV7 em Portugal, um país onde a vacina, apesar de não se encontrar no plano nacional de vacinação, está a ser prescrita pelo sector privado desde o ano 2001. Para tal, procedeu-se à caracterização de 475 estirpes isoladas de infecção invasiva em crianças e adolescentes (<18 anos) entre 2003 e 2008, recorrendo a métodos de serotipagem, determinação da susceptibilidade aos antimicrobianos e tipagem molecular. Os dados obtidos neste estudo foram comparados com resultados anteriores de modo a inferir possíveis alterações na população pneumocócica após disponibilização da vacina. Os resultados obtidos demonstraram uma redução significativa dos serotipos incluídos na vacina PCV7 em infecção invasiva. No entanto, este decréscimo foi acompanhado por um aumento de serotipos não vacinais na população, nomeadamente o 1, 19A e 7F. Dado que o pneumococo pode apresentar diversas linhagens genéticas dentro do mesmo serotipo era importante não só determinar quais os clones associados aos serotipos em expansão como também averiguar a existência de proximidade genética dos clones encontrados nos períodos pré e pós-vacinais. A tipagem molecular das estirpes isoladas de infecção permitiu verificar que os clones associados aos serotipos em expansão já tinham sido identificados no período pré-vacinal. Consequentemente, o aumento da prevalência de alguns serotipos resultou da disseminação de clones em circulação em Portugal, não se tendo verificado situações de transformação capsular nos serotipos mais prevalentes. Um dos serotipos mais prevalentes em infecção e associado à resistência aos antibióticos no período pós-vacinal foi o serotipo 19A. Diversos estudos demonstraram a sua importância em infecção invasiva apesar de se ter verificado diferenças significativas entre os clones reportados em Portugal e os clones descritos nos EUA. Enquanto que em Portugal a principal linhagem genética em circulação era a representada pelo clone Denmark14-ST230, nos EUA a expansão do 19A resultou do aumento do clone composto pelos ST320 e ST199. Com o intuito de averiguar se o clone associado ao aumento do serotipo 19A em Portugal estava restricto à população pneumocócica invasiva, procedeu-se à caracterização de todas as estirpes de serotipo 19A isoladas de infecção (invasiva e não invasiva) e de portadores assintomáticos, entre 2001 e 2006. Foram identificadas algumas linhagens associadas à colonização (ST1151 e ST416) e outras associadas à infecção invasiva (ST193). Porém, o principal clone deste serotipo foi encontrado nas três populações em estudo e está associado à expansão do serotipo 19A. Um dos principais problemas da vacina PCV7, assim como das vacinas recentemente introduzidas PCV10 e PCV13, é o número restricto de serotipos que esta vacina protege. Isto, em conjunto com o aumento de serotipos não incluídos na PCV7 após a introdução desta, tem levado a uma necessidade de novas estratégias vacinais para a prevenção da infecção pneumocócica. Foram identificadas recentemente proteínas na superfície do pneumococo que compõem estruturas do tipo pili. Uma vez que estas proteínas são bastante imunogénicas foi proposta a sua utilização na formulação de uma nova vacina anti-pneumocócica. Porém, a distribuição destas estruturas na população pneumocócica não está totalmente definida. Com o intuito de averiguar a potencial utilização destas proteínas numa vacina, procedemos à determinação da prevalência dos dois pili até agora identificados em S. pneumoniae, numa colecção de estirpes invasivas isoladas de crianças e adolescentes (