Inibição do HIV-1 por fragmentos de anticorpos sintéticos

Tese de mestrado. Microbiologia Aplicada. Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009A proteína transmembranar gp41 medeia a entrada do HIV-1 na célula hospedeira, conjuntamente com a glicoproteína de superfície gp120. A interacção desta com o receptor celular CD4 induz alterações conformacionais no ectodomínio da g41 (conformação de pré-fusão) que colapsam na fusão da membrana celular e do invólucro viral, através da formação de uma conformação fusogénica. Diferentes classes de fármacos anti-retrovirais encontram-se disponíveis no mercado, constituindo o enfuvirtide o único péptido inibidor de fusão aprovado pela FDA. O objectivo deste trabalho consistia no bloqueio das alterações conformacionais que ocorrem no ectodomínio da gp41 durante o processo de fusão do HIV-1 e da célula-alvo. Este bloqueio pretendia-se que fosse efectuado pela ligação de single domain VL antibodies, formatos de anticorpos de reduzida massa molecular, ao ectodomínio da gp41 e em particular a uma região deste, a região em α-hélice HR1. Esta é conservada entre os diferentes isolados do HIV-1 e imprescindível para a formação da conformação fusogénica, o que consequentemente a torna numa região com um papel crítico na entrada do HIV-1 na célula hospedeira. Os single domain antibodies foram seleccionados pela tecnologia de phage display a partir de uma biblioteca sintética, em que as ansas CDR1 e CDR3 originais foram substituídas por regiões de vinte e dois aminoácidos. Doze destes sendo aleatoriamente serinas, alaninas, aspartatos ou tirosinas e os restantes dez sendo serinas e glicinas que providenciaram flexibilidade às ansas. A partir da biblioteca sintética foram isolados cinco single domain antibodies inibidores em cerca de 20% da infecciosidade do HIV-1 em células TZM-bL, sendo dois destes específicos para a região HR1. Os single domain VL antibodies apresentam-se deste modo como promissores agentes terapêuticos na inibição da infecção pelo HIV-1, como uma alternativa às classes de anti-retrovirais existentes.The gp120 glycoprotein and gp41 protein are responsible for the entry of HIV-1 in target cells. The interaction of gp120 with cellular receptor CD4 induces conformational changes in the gp41 ectodomain (pre-fusion conformation) that collapses in the fusion of the cellular membrane and the virus envelope, through a fusogenic conformation of the gp41 ectodomain. There are several antiretroviral molecules in the market, the enfuvirtide is the only fusion inhibitor approved by FDA. The goal of this work was the inhibition of HIV-1 infection, by blocking the conformational changes that occurs in gp41 ectodomain during the fusion process. This goal was achieved through the binding of single domain VL antibodies, reduced antibody formats, to the gp41 ectodomain and particularly the α-helice HR1 region. The HR1 region is essential for the fusion process, namely for the formation of the fusogenic conformation, and conserved among HIV-1 isolates. The single domain VL antibodies were selected by phage display technology from a synthetic library, which was constituted of single domain antibodies composed of CDR1 and CDR3 with twenty two aminoacids. Twelve of these were randomized to four aminoacids (serine, alanine, tyrosine and aspartic acid), being the remain ten serines and glycines providing flexibility to the loops. Five single domain VL antibodies were selected like inhibitors in 20% of the HIV-1 infection in TZM-bL cells, two of these was specific for the HR1 region. The single domain VL antibodies present themselves like promising therapeutic agents in HIV-1 infection, competing with the existing antiretroviral therapies