Dynamics and interactions of nuclear proteins revealed by quantitative photobleaching microscopy

Tese de doutoramento em Biofísica (Biofísica), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2007The nucleus is a complex cellular organelle, exhibiting a high degree of organization and also a highly dynamic nature. Live cell imaging using fluorescent proteins (FPs) as molecular tags and photobleaching techniques have been essential in revealing the dynamic nature of the cell nucleus. In this thesis, these tools were used to study molecular dynamics and interactions inside this cellular compartment. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) were used to analyze the kinetic behavior of spliceosome components SmE, U2AF65, U2AF35, SF1 and SC35 in the nucleus of living cells. The recruitment mechanism of splicing factors (SFs) to the sites of transcription is still poorly understood. Our results rule out the hypothesis that a transcription specific signal recruits SFs from the speckles. They also suggest the formation of multi-protein complexes distinct from the spliceosome. The existence of these complexes was confirmed by Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) techniques, which revealed that SFs could interact with each other even in the absence of active splicing. A novel U2AF65 self-interaction was also detected, suggesting altogether that levels of SFs in speckles are consistent with self-organization mechanisms. The intranuclear mobility of mRNPs was studied using two GFP-tagged mRNA-binding proteins, PABPN1 and TAP, as mRNA markers. A novel FLIP method was devised to quantify the mobility of the RNA-bound and unbound pools of molecules and used to test whether myosin motors were implicated in mRNP movement. We show that this is not the case and that myosin inhibition appears to affect transcription instead. A novel FLIP after Photoactivation method was developed to study the nucleocytoplasmic exchange dynamics of nuclear proteins, yielding the permanence times of molecules inside the nucleus. The method was used to study the role of the structural domains of TAP in its shuttling activity.O núcleo celular é um organito complexo, dotado de um elevado grau de organização mas também uma natureza extremamente dinâmica. A utilização de proteínas fluorescentes como marcadores moleculares para visualização em células vivas, bem como as técnicas de photobleaching, têm sido essenciais na descoberta da natureza dinâmica do núcleo. Neste trabalho, estas ferramentas foram aplicadas no estudo da dinâmica e interacções moleculares dentro deste compartimento celular. As técnicas de Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) e Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) foram utilizadas na análise do comportamento cinético dos componentes do spliceosoma SmE, U2AF65, U2AF35, SF1 e SC35 no interior do núcleo de células vivas. O mecanismo de recrutamento dos factores de splicing (SFs) para os locais de transcrição é ainda pouco conhecido. Os nossos resultados excluem a hipótese de haver um sinal associado à transcrição que seja responsável por este recrutamento. Sugerem ainda a formação de complexos multi-proteicos distintos do spliceosoma. A existência destes complexos foi confirmada por técnicas de Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), que mostraram que os SFs podiam interagir uns com os outros mesmo na ausência de splicing activo. Foi ainda descoberta uma nova auto-interacção para o factor U2AF65, sugerindo os resultados no seu conjunto que a distribuição de SFs no núcleo é compatível com mecanismos de auto-organização. A mobilidade de mRNPs no núcleo foi estudada utilizando como marcadores moleculares duas proteínas que se ligam ao mRNA marcadas com GFP, PABPN1 e TAP. Foi desenvolvido um método de FLIP para quantificação da mobilidade das fracções ligadas e não ligadas ao mRNA e usado para testar a possibilidade de motores de miosina estarem envolvidos no movimento de mRNPs. Mostramos que tal não acontece e que a inibição de miosina parece antes afectar a transcrição. Um novo método de FLIP após foto-activação foi desenvolvido para estudar a dinâmica de trocas entre o núcleo e o citoplasma de proteínas nucleares, permitindo a estimação do tempo de permanência de moléculas dentro do núcleo. O método foi utilizado para investigar o papel dos diferentes domínios estruturais da proteína TAP na sua actividade de exportação nuclear.Fundação para a Ciência e Tecnologia (BD/21518/99); European Commission (“RNOMICS” QLG2-CT-2001-01554 and “Integrated Technologies for in vivo Molecular Imaging” LSHG-CT-2003-503259