Malarial pigment (hemozoin): flow cytometric detection of hemozoin in infected erythrocytes to monitor drug-effects

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010A malária é uma doença que tem sido uma preocupação constante para a humanidade ao longo de séculos, continuando a ser responsável por cerca de 1 milhão de mortes por ano.84 O impacto da malária é elevado estende-se muito além das taxas de mortalidade e morbilidade associadas.20 A malária em humanos é causada por cinco espécies de parasitas: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae e Plasmodium knowlesi. O parasita Plasmodium falciparum é responsável pela maioria dos casos em África e dos casos de malária severa. Estas cinco espécies diferem na distribuição geográfica, características microscópicas, características clínicas e no potencial para desenvolver resistência aos anti-maláricos. O ciclo de vida do parasita é complexo e envolve um vector e um hospedeiro vertebrado. Durante o ciclo de vida, no hospedeiro, existem duas fases principais: fase hepática e a fase sanguínea. Durante a fase sanguínea o parasita invade eritrócitos, desenvolve-se e multiplica-se no seu interior. Esta fase é a responsável pela sintomatologia associada à infecção por malária. Durante o desenvolvimento do no interior dos eritrócitos o parasita degrada a hemoglobina para obter aminoácidos e para regular a pressão ósmotica.28 Como consequência desta degradação é produzido heme livre. Este, tal como acontece em organismos superiores, é tóxico para o parasita.78 Para ultrapassar este obstáculo o parasita desintoxica o heme livre transformando-o em hemozoína (Hz), também denominado por pigmento malárico.39 O conteúdo de Hz aumenta à medida que o parasita matura constituindo, assim, um óptimo indicador de crescimento.7 Vários anti-maláricos interferem com a produção de Hz. Fármacos que contêm quinolina, como a cloroquina, quinino, mefloquina, amodiaquina e halonfantrina têm como principal mecanismo de acção a inibição da produção de Hz, levando à morte do parasita, como uma consequência da acumulação de heme livre tóxico.28,69,78 Outro grupo de fármacos que também pode estar envolvido na inibição da produção de Hz é eventualmente a artemisina e os seus derivados.55 Apesar de existirem algumas provas que apontam para o envolvimento da Hz, o mecanismo de acção deste fármacos é um tema controverso, e ainda não está completamente esclarecido. Nas últimas décadas tem-se vindo a observar um aumento da resistência a determinados antimaláricos. A resistência aos anti-maláricos é um grave problema de saúde publica, uma vez que está associado à propagação da malária a novas áreas e ao reaparecimento em regiões onde fora erradicada.6 Perante este cenário torna-se imprescindível ter conhecimento das susceptibilidades do parasita aos diferentes anti-maláricos. Actualmente existem diversos testes de sensibilidade. Basicamente, podemos agrupá-los em: ensaios in vivo e ensaios in vitro. Estes testes são úteis para definir guidelines para politicas de saúde pública, são ferramentas essenciais para o desenvolvimento de novos fármacos e para a epidemiologia da resistência a anti-maláricos. Por outro lado possuem diversas limitações, como o longo turn-around time (30 h - 96 h), o uso de equipamento sofisticado e de reagentes dispendiosos e difíceis de adquirir. Estas limitações contribuem para o desenvolvimento de novos métodos capazes de as ultrapassar. Este projecto tem como principal objectivo o desenvolvimento de um teste de sensibilidade com base na detecção de Hz por citometria de fluxo. Devido às propriedades físicas da Hz (birrefringente), esta pode ser detectada por métodos ópticos, como por citometria de fluxo. Recorrendo a um citómetro modificado foi possível detectar eritrócitos infectados (Ei) contendo diferentes quantidades de hemozoína. Amostras de sangue, colhidas de ratinhos infectados com Plasmodium berghei, foram incubadas (in vitro) com vários anti-maláricos (cloroquina, quinino, mefloquina, artemisinina e pirimetamina), durante 24 horas de incubação. Analisando a percentagem de Ei contendo uma elevada quantidade de Hz, denominadas “eritrócitos infectados que depolarizam muito” (Ei-dm), foi possível detectar o efeito inibitório dos fármacos. A avaliação da percentagem de Ei-dm, possibilitou a detecção de um aumento da quantidade de Hz no interior dos Ei, consequência da maturação do parasita. Contrariamente, nas amostras tratadas com cloroquina, quinino, mefloquina e artemisinina não foi detectado nenhum aumento, indicando que os fármacos inibiram o crescimento do parasita e, consequentemente, não foi produzida mais Hz. Curiosamente nas amostras tratadas com cloroquina detectou-se uma diminuição acentuada na percentagem de Ei-dm nas primeiras horas de incubação. Este resultado inesperado revelou-se ser consequência da agregação dos cristais de Hz. Este fenómeno de agregação, denominado “clumping”, foi descrito anteriormente, onde na presença de cloroquina os cristais de Hz formam um agregado.76 A detecção de Ei-dm resulta da avaliação da depolarização da luz que é dispersada lateralmente (depolarized side scattered light: depolarized-SSC). Este parâmetro, SSC, é um indicador da granulosidade celular.64 Deste modo, é muito provável que o depolarized-SSC possa também ser influenciado pela granulosidade celular. Neste caso, se um Ei possuir cristais de Hz dispersos e outro tiver um agregado de Hz, o sinal de depolarized-SSC será menor no Ei com um agregado de Hz no seu interior, fazendo com que estes Ei deixem de pertencer à população de Ei-dm. Justificando-se, assim, a diminuição inicial na percentagem de Ei-dm nas amostras tratadas com cloroquina. Relativamente à pirimetamina nenhum efeito foi detectado. Este resultado não foi de todo inesperado, uma vez que a pirimetamina actua numa fase tardia da maturação do parasita (no esquizonte).50 Deste modo, o efeito da pirimetamina é apenas detectado após um ciclo de replicação, ou seja, nas gerações seguintes de parasitas. Devido ao modelo experimental usado (murganhos infectados com Plasmodium berghei), a cultura de Ei testada apresenta apenas uma geração de parasitas. Isto porque P. berghei in vitro não é capaz de romper os eritrócitos e, consequentemente, não re infecta novos eritrócitos.32 A artemisina é um fármaco cujo mecanismo de acção permanece desconhecido. Possíveis mecanismos como o envolvimento na produção de hemozoína55 e a alteração das membranas do parasita26, têm vindo a ser sugeridos nos últimos anos. Os resultados obtidos demonstram que na presença de concentrações mais elevadas de artemisina (129 nM e 259 nM) há um decréscimo gradual da percentagem de Ei-dm, a partir das 2 horas de incubação. Este resultado pode sugerir que tal como acontece com a cloroquina, mas não tão rapidamente, o pigmento pode começar a agregar-se, ou então, que o fármaco pode provocar a lise dos Ei. Nenhuma destas hipóteses pôde ser confirmada porque durante esta experiência não foram adquiridas contagens absolutas da concentração de eritrócitos presentes nas amostras. A utilização de estirpes de parasitas que expressam GFP (green fluorescent protein) para o screening de anti-maláricos e determinação da do parasita a diferentes compostos sensibilidade foi descrita tanto para P. falciparum como para P. berghei. 60,61 Na maioria das experiências realizadas ao longo deste projecto foram usadas estirpes de parasita que expressam GFP para que fosse possível comparar os resultados obtidos através destas duas abordagens (detecção de parasitas que expressam GFP ou detecção de Ei-dm). O efeito do fármaco foi detectado com uma maior antecedência e evidência através da análise da percentagem de Ei-dm. Concluindo, a detecção por citometria de fluxo de Ei contendo diferentes quantidades de Hz permitiu a avaliação do efeito inibitório de todos os anti-maláricos testados, à excepção da pirimetamina, em apenas 4 horas de incubação. Apesar dos resultados do projecto demonstrarem o potencial deste ensaio é preciso ter em conta que o objectivo principal é desenvolver um teste de sensibilidade para Plasmodium spp. responsáveis pela malária em humanos e, para isso, uma cultura contínua de P. falciparum está a ser estabelecida. No futuro será também importante testar estirpes de P. falciparum resistentes de modo a optimizar o ensaio. Posteriormente, será também de interesse a recolha e análise de amostras de sangue de doentes com malária num país onde esta doença é endémica.Malaria remains the most important parasitic disease. The emergence and spread of drug resistant Plasmodium falciparum is a subject of great concern and requires monitoring of the parasite susceptibility. Currently there are several sensitivity assays for Plasmodium falciparum but they are associated with important limitations, such as: long turn-around times (30 h - 96 h), use of expensive equipment and sophisticated or labour-intensive methodologies. Malaria parasites produce hemozoin (Hz), in order to detoxify heme after hemoglobin degradation. Hz content increases during parasite maturation, thus constituting an optimal growth indicator. Due to its physical property (birefringence) it can be detected by optical methods, like flow cytometry. Using a purpose built flow cytometer, it was possible to detect infected red blood cells (iRBCs) containing different amounts of Hz. The principal goal of this project is to develop a rapid and reliable sensitivity assay. This kind of assay will surely be a great tool for the assessment of parasite susceptibility and for the high throughput screening of new compounds. Blood from Plasmodium berghei infected mice was incubated (in vitro) with several antimalarial drugs (chloroquine, quinine, mefloquine, artemisinin and pyrimethamine), over 24 hours. Analysing the percentage of iRBCs containing high amounts of Hz, denominated as highly depolarizing RBCs (hdRBCs), it was possible to detect the inhibitory effect of several drugs. In the untreated samples the amount of Hz within iRBCs increased, as assessed by the percentage of hdRBCs, due to parasite maturation. Contrary to this, no increase was detected in samples treated with chloroquine, quinine, mefloquine and artemisinin. Pyrimethamine effect could not be detected. The inhibitory effect of all antimalarial drugs tested, excluding pyrimethamine, could be detected already after 4 hours of incubation. These preliminary results suggest that this method could be developed into a rapid, objective and automatable sensitivity test, without the need for reagents