Role of CenH3/CENP-A in the regulation of centromere function and chromosome segregation

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Os centrómeros são estruturas especializadas do cromossoma, com uma composição de cromatina única, que desempenham um papel chave nos processos de segregação dos cromossomas durante a mitose e meiose para além de determinarem o local de formação do cinetócoro. A formação e propagação do centrómero é um exemplo claro de um processo epigenético, isto é, estruturas proteicas são formadas ou associadas ao DNA e depois estavelmente propagadas através de numerosas divisões celulares numa maneira que é independente da sequência de DNA. Mais especificamente o cinetócoro é uma estrutura fundamental formada no final da prófase na região centromérica que é responsável por mediar a ligação dos cromossomas as fibras do fuso, monitorizar a ligação bipolar e puxar os cromossomas para os pólos durante a anáfase. O centrómero apesar de já ter sido identificado há muito tempo como a primeira constrição dos cromossomas metafásicos, a sua caracterização molecular ainda permanece um pouco inconclusiva devido ao seu invulgar enriquecimento em sequencias DNA satélite (a excepção dos centrómeros das leveduras gemulação). Para além do seu valor biológico intrínseco, o estudo e a análise do centrómero é também importante sob uma perspectiva biomédica uma vez que alterações na função centromérica levam frequentemente às aneuploidias (perda ou ganho de cromossomas) que muitas vezes levam a letalidade. Os centrómeros Eucarióticos podem ser classificados como monocêntricos ou holocêntricos. Os monocêntricos caracterizam-se por serem localizados, isto é, a sua formação é restrita a um específico loccus cromossomal, já nos holocêntricos,o centrómero forma-se difusamente ao longo de todo o cromossoma. Neste trabalho, pretendeu-se aprofundar o conhecimento acerca da estrutura e função da cromatina centromérica uma vez que tem um papel fundamental na segregação cromossomica, usando para este estudo como organismo modelo a mosca Drosophila melanogaster. Uma das características da cromatina centromérica é a presença de uma específica variante da histona H3, genericamente designada por CenH3, que substitui a histona canónica H3.1 nos nucleossomas quer in vivo quer in vitro. O que se verifica é que na ausência de CenH3, a função centromérica e a localização de outros componentes do cinetócoro é abolida e pelo contrário experiências em que se procedia a sobrexpressão da CenH3 humana (CENP-A) isso levava a sua mislocalization para os braços cromossomicos onde recrutava componentes do cinetócoro levando muitas vezes a formação ectópica de cinetócoros, afectando a progressão no ciclo celular. Em Drosophila a CenH3 designa-se por Cid (centromere identifier) e é extremamente divergente da H3 canónica uma vez que apresenta um domínio N-terminal altamente variável, que pode ir desde os 20 aos 200 aminoácidos, não apresentando quase nenhuma homologia. O domínio C-terminal de Cid, mais especificamente o HFD, já apresenta uma significante homologia com a H3 mas apenas 48% de identidade dentro da filogenia. E portanto é fácil de perceber que estas diferenças tenham levado a uma rápida evolução das CenH3 o que reflecte a sua especialização funcional. Assim se identifica esta CenH3 como sendo a marca epigenética que nos permite identificar o centrómero, uma vez que existe uma falta de conservação no que diz respeito a sequência de DNA, isto é, não existe uma especifica sequência de DNA que seja necessária e suficiente para levar a formação do centrómero (excepção nas leveduras de gemulação). No entanto o exacto mecanismo molecular pelo qual a específica deposição de CenH3 ocorre nos centrómeros ainda não é bem conhecida, o que se sabe é que no caso da Drosophila melanogaster, e com base nestas observações enunciadas anteriormente, a CenH3 funciona ou é fundamental quer estrutural quer funcionalmente para o cinetócoro mais especificamente para a sua formação o que lhe confere a capacidade de ser a proteína identificadora da função centromérica e daí o interesse do estudo dos mecanismos que levam a sua deposição e regulação durante o ciclo celular. A analise das fibras de cromatina de Drosophila revelaram que a região centromérica em realidade não esta composta exclusivamente por nucleossomas que contem a cenH3 senão que há uma distribuição em blocos de nucleossomas com a H3 intercalados com nucleossomas com cenH3 (Blower et al. 2002). Assim os nucleossomas que contem a CenH3 são a base para uma correcta organização do cinetócoro e a sua formação é independente da replicação (Henikoff et al. 2001). Pensa-se que este processo possa iniciar-se com interacções entre o DNA e o Loop1 da região C-terminal da CenH3-H4 e quando a totalidade do nucleossoma ((H2A-H2B)2(H3-H4)2) é formado, a região N-terminal da CenH3 interactuara com o DNA de ligação. A nível do ciclo celular sabe-se que a expressão de CenH3CENP-A surge no início da fase S mas os seus níveis só atingem um máximo em G2 sendo que a sua deposição ocorre no final da mitose (final da telófase) inicio da G1. Sabe-se no entanto que mecanismos adicionais tem de existir para evitar quer a deposição de nucleossomas contendo CENP-A em locais não centroméricos durante a replicação do DNA e/ou para remove-los após a replicação do DNA. No caso de Drosophila em embriões não são observadas as fases gap (G1/G2) mas a deposição de CenH3Cid também tem lugar durante a mitose mais concretamente em Anáfase. Em suma CenH3 é essencial para a função centromérica uma vez que em todos os eucariotas analisados até a data, a depleção de CenH3 é letal quer a nível da célula quer a nível do organismo. Para aprofundar o conhecimento acerca desta proteína vamos verificar qual o mecanismo que regula os seus níveis na célula, através do uso de mutantes para os genes β2 e/ou β6 do proteossoma 26S (via de degradação mais comum dos eucariotas) investigou-se o seu papel na possível regulação de Cid via proteossoma. A caracterização fenotípica sugere que estes genes têm papéis importantes uma vez que mutantes nestes genes actuam de uma maneira dominante-negativa que interfere com as funções do proteossoma, assim usando linhas UAS-GAL4 com mutantes nestes genes e verificando qual a localização de Cid nas células de discos imaginais (pequeno grupo de células progenitoras tecido-específicas que se mantêm quiescentes durante a embriogénese e que proliferam durante o desenvolvimento larvar afim de originarem a maioria das futuras estruturas do individuo adulto) será um dos objectivos a que nos propomos. Numa segunda parte do trabalho estamos interessados em perceber que complexos do ciclo celular estão envolvidos na regulação de Cid, pela adição de uma cauda de ubiquitina a esta proteína que depois pode então ser reconhecida pelo proteossoma. Iremos analisar em específico o complexo SCF (Skip, Cullin, F-box), um complexo multi-proteico E3 ubiquitina ligase que catalisa a ubiquitinação de proteínas destinadas a degradação proteossomal, visto que já foi testado que a F-box deste complexo interactua directamente com Cid in vitro. Pela utilização de linhas RNAi contra as subunidades Skp1 (16983R-III e CG16983) e Cul1 (1877-III e CG1877) deste complexo iremos analisar a localização de Cid nestes mutantes em neuroblastos (células progenitoras que dão origem ao sistema nervoso) de larvas de Drosophila. Também foi realizado um pequeno ensaio experimental de expressão transitória em células Kc de Drosophila com o objectivo de provar se o CATD (CENP-A targeting domain) de Cid é necessário e suficiente, como nos mamíferos, para determinar a sua localização centromérica. Com isto podemos aprofundar o conhecimento a cerca das vias reguladoras de deposição e eliminação desta proteína chave centromérica e perceber como isso afecta o recrutamento de outras proteínas importantes para a formação do cinetócoro, para a função do fuso mitótico entre outros.The centromere is a specialized structure of the chromosome that plays a key role in the process of chromosome segregation during mitosis and meiosis. Surprisingly, the centromere appears to represent the most stable form of epigenetic inheritance known to date since it is maintained not only through mitotic divisions but also through the germ line. Although the histones are one of the most conserved proteins, one of the characteristics of the centromeric chromatin is the presence of a specific histone H3 variant (CenH3), which replaces canonical H3.1 in all eukaryotic centromeres. CenH3 appears to dictate centromere identity, being required for the kinetochore formation and for a correct centromere function. However, the precise molecular mechanisms accounting for its specific deposition at centromeres are not well understood. In a previous work had been showed that transiently expressed Cid, the CenH3 of Drosophila melanogaster, is incorporated throughout chromatin and that this mislocalization affects cell cycle progression. Therefore, expression of CenH3 must be tightly regulated during cell cycle to prevent deposition at non centromeric sites and additional mechanisms must exist to either avoid deposition of CenH3 containing nucleosomes at non centromeric sites and/or to remove them afterwards. Previously had been showed how a process of proteasome degradation contributes to the centromeric localization of Cid by eliminating mislocalized Cid as well as by regulating available Cid levels. To be recognised by the proteasome Cid requires to be polyubiquitinated , a function that it´s performed by a sequential action of 3 enzimes : E1, E2 and E3. The activity of E3 it´s essential since it´s involved in substract recognition, where upon they become substrates for the proteolytic machine, the proteasome. One of the major E3 are the SCF (Skp1, Cul1, F-box) complex that will be analysed since one of the F-box protein of this complex Ppa (partener of paired) interacts directly in vitro with Cid and this interaction could contribute to the proteolytic degradation of CID