Estudo do controlo pós-transcricional da hemojuvelina e sua influência na homeostase do ferro

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Uma classe importante das doenças humanas é representada por doenças hereditárias associadas à homeostase do ferro, entre as quais se destaca a Hemocromatose Hereditária (HH). Esta caracteriza-se por uma alteração dos mecanismos que regulam a absorção do ferro, levando ao aumento progressivo deste no organismo. Um dos tipos de HH é a Hemocromatose Juvenil (2A) causada por mutações no gene da hemojuvelina (HJV), envolvido na regulação do metabolismo do ferro através da modulação directa da transcrição do gene da hepcidina. De maneira a perceber o papel do controlo pós-transcricional do gene HJV na homeostase do ferro foram analisados vários aspectos do metabolismo dos transcritos HJV, nomeadamente ao nível do splicing, do controlo de tradução por grelhas de leitura a montante da grelha de leitura principal (uORFs) e a sua degradação pelo mecanismo de decaimento do mRNA mediado por mutações nonsense (NMD). Foi analisado o padrão de splicing em diferentes tecidos, transfectados e não transfectados, e os resultados indicam que o transcrito que codifica a proteína funcional não é produzido em quantidades elevadas, provavelmente fruto de um controlo rigoroso ao nível do splicing alternativo. Foi ainda detectada uma variante de splicing inicialmente referida no artigo de Papanikolaou e colaboradores (2004), mas cuja sequência não se encontra anotada nas bases de dados do transcriptoma. Verificou-se também que a HJV tem duas uORFs funcionais que inibem consideravelmente a eficiência de tradução da ORF principal, tendo a uORF1 um papel mais preponderante nesta inibição. O reconhecimento do AUG principal é feito, pelo menos, através do mecanismo de leaky scanning. Foi ainda demonstrado através de construções repórter que as uORFs da HJV são passíveis de induzir o NMD, sugerindo fortemente que na sua forma nativa o transcrito da HJV pode ser regulado por este mecanismo.An important class of human diseases is represented by inherited disorders related do iron homeostasis, among which is Hereditary Hemocromatosis (HH). It is characterized by an alteration of the mechanisms that regulate iron absorption, leading to its progressive increase in the body. Juvenile Hemocromatosis (2A) is a type of HH, caused by mutations in the hemojuvelin (HJV) gene, involved in the regulation of iron metabolism through direct modeling of the transcription of the hepcidin gene. In order to understand the role of the post-transcriptional control of the HJV gene in iron homeostasis, several aspects of the transcript metabolism were analyzed, namely its splicing pattern, its translational control through upstream open reading frames (uORFs) and its degradation through the nonsense mediated mRNA decay (NMD) mechanism. The splicing pattern was analyzed in different transfected and non transfected tissues, and the results reveal that the transcript that codifies for the functional protein is not easily detected, suggesting it is not present at high levels, probably due to a rigorous control at the alternative splicing level. Moreover, a splicing variant was detected, initially referred in Papanikolaou et al (2004), whose sequence, however, is not annotated in transcriptome databases. Additionally, we have observed that HJV mRNA has two functional uORFs which considerably inhibit the translational efficiency of the main ORF, having the first uORF a more prominent role in the translational control. The recognition of the main ORF is achieved, at least, by leaky scanning. It was also demonstrated through reporter constructions that HJV´s uORFs are sensitive to NMD, strongly suggesting that the native HJV mRNA could be naturally regulated by this mechanism