Caracterização molecular de hemoglobinopatias raras associadas ao agrupamento génico da beta-globina

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010A hemoglobina (Hb) é a proteína do sangue responsável pelo transporte de oxigénio para todos os tecidos do organismo. As suas quatro subunidades proteicas - as globinas - são codificadas nos agrupamentos génicos α- e β-globina, localizados respectivamente no cromossoma 16 (16p13.3) e 11 (11p15.5). Alterações moleculares nos genes globínicos ou nas suas regiões regulatórias, podem dar origem a uma patologia designada, genericamente, por hemoglobinopatia. Esta inclui as talassémias, resultando de alterações moleculares diversas que reduzem ou anulam a expressão de um ou mais genes globínicos, apresentando, os indivíduos portadores, um fenótipo hematológico típico. Neste trabalho foram seleccionados 20 indivíduos com fenótipo hematológico indicativo de hemoglobinopatia cuja causa molecular não era até então conhecida. Foi realizado, recorrendo a várias metodologias, incluindo a nova metodologia de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphims), sequenciação automática e gap-PCR, o estudo do agrupamento génico β-globina destes indivíduos, com a finalidade de caracterizar molecularmente a sua patologia. Foram detectadas neste estudo mutações pontuais raras já descritas (HBG1:c.-211C>T e HBG1:c.-248C>G) e a duplicação do gene Gγ-globina, que justificaram a elevada percentagem atípica da hemoglobina fetal apresentada por alguns indivíduos. Foram também caracterizadas duplas heterozigotias (HBD:c.82G>T e HBB:c. 92+1G>A ou HBB:c.118C>T) em indivíduos cujo fenótipo hematológico poderia induzir a um diagnóstico talassémico erróneo. Foram ainda caracterizadas quatro delecções diferentes: duas já descritas (NG_000007.3:g.59478_144395del84918 e NG_000007.3:g. 57237_64443 del7207), uma provavelmente nova que remove pelo menos 3kb da região 3’ do agrupamento génico β-globina, e uma outra ainda não descrita, do tipo εγδβ0-talassémica, em que todo o agrupamento e alguns genes a jusante estão ausentes (numa extensão máxima de 208kb). Com este trabalho foi possível esclarecer a base molecular de vários casos clínicos com fenótipos atípicos de hemoglobinopatia, o que permitiu incrementar o conhecimento científico na fisiopatologia desta doença e na compreensão da complexa regulação da expressão dos genes globínicos.Hemoglobin is the blood’s protein responsible for the transport of oxygen to all tissues of the organism. It has four proteic subunits - the globins – are encoded in in α- and β-globin gene clusters on chromosome 16 (16p13.3) and 11 (11p15.5) respectively. Molecular modifications in globin genes or in their regulatory regions may give rise to a pathology named hemoglobinopathy. This includes the thalassemias caused by diverse molecular alterations which reduce or abolish the expression of one or more globin genes, resulting in a typical hematologic phenotype. In this work we selected 20 individuals presenting a typical hemoglobinopathy phenotype, which molecular cause was still not known. The study of the β-globin gene cluster of these individuals involved many methodologies, including the new methodology of MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphims), automated sequencing and gap-PCR, with the purpose of molecularly characterize the pathology presented by them. Rare point mutations already described (HBG1:c.-211C>T and HBG1:c.-248C>G) and Gγ-globin gene duplication, explaining the higher level of fetal hemoglobin presented by some individuals. Double heterozygothies were also characterized (HBD:c.82G>T and HBB:c.92+1G>A or HBB:c.118C>T) in individuals whom hematologic phenotype could bring to a false thalassemic diagnosis. In addition, four different deletions were characterized: two already described (NG_000007.3:g.59478_144395 del84918 and NG_000007.3:g. 57237_64443 del7207), one probably new which removes at least 3kb of the 3’ region of the β-globin gene cluster, and new εγδβ0-thalassemic deletion, in which the entire cluster and some downstream genes are deleted (less than 208kb long). With this study it was possible to clear the molecular base of some clinic cases with atypical hemoglobinopathy phenotype, contributing to increment the scientific knowledge in the fisiopatology of this disease and in the comprehension of the complex regulation of the globin genes expression