Estudo molecular da resistência à rifampicina do complexo Mycobacterium tuberculosis numa população da Guiné-Bissau

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010A tuberculose é uma das doenças infecciosas mais antigas que afecta a ser humano. Segundo a Organização Mundial de Saúde, um terço da população mundial encontra-se infectada com o bacilo da tuberculose. Os dados limitados sobre a resistência aos antibacilares em países em desenvolvimento ocorre, em parte, devido à carência de condições para efectuar cultura e testes de susceptibilidade aos antibióticos (TSA). Os métodos moleculares para a detecção de mutações, que conferem resistência aos antibióticos, têm sido considerados úteis nestes contextos, podendo ser realizados em colaboração com laboratórios com capacidade de efectua-los. O estudo molecular foi realizado em amostras biológicas (expectorações) de doentes com diagnóstico presuntivo de tuberculose do Hospital de Cumura, na Guiné-Bissau. Este estudo mostrou que o Método da Lixívia, utilizado no processamento das amostras, melhora a sensibilidade da microscopia e é compatível com posterior análise molecular, e que a técnica de Cromatografia Líquida de Alta Resolução por Desnaturação (DHPLC), usada no rastreio rápido de mutações pontuais na região de 81pb determinante da resistência à rifampicina do gene rpoB (codifica para a subunidade β da RNA polimerase) de complexo Mycobacterium tuberculosis, é útil na selecção de genótipos mutantes potencialmente resistentes. As mutações foram confirmadas por sequenciação, tendo os resultados revelado uma nova mutação S469L (27/94; 28,7%) e a mutação S531L (3/94; 3,2%), esta última implicada na resistência à rifampicina. Pelo teste GenoType ® MTBDRplus, foi detectada uma estirpe multirresistente. Da análise de sequências correspondentes a estirpes de referência do GenBank, verificou-se que a mutação S469L está apenas presente na estirpe Mycobacterium tuberculosis K85. Não se sabe ainda, se esta mutação está associada a um fenótipo de resistência ou se será um possível marcador desta estirpe. Futuramente seria interessante realizar TSA e estudos genotípicos em estirpes com a mutação S469L.Tuberculosis is one of the most ancient infectious diseases affecting human beings. According to the World Health Organization, one third of the world population is infected with the tuberculosis bacillus. There is limited data on antituberculosis drug resistance in developing countries. This is partly due to the lack of conditions to perform culture and drug susceptibility testing (DST). Molecular methods for the detection of drug resistance have been considered useful in these settings as these can be carried out in collaboration with laboratories having the capacity to perform these methods. Molecular analysis was carried out on specimens from patients with presumptive diagnostic of tuberculosis of the Cumura Hospital in Guinea-Bissau. This study shows that the Bleach Method, for processing specimens, improves the sensitivity of microscopy and can be used prior to molecular analysis and that Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (DHPLC), used for the rapid screening of point mutations in the 81 pb rifampicin resistance-determining region of the rpoB gene (enconding the beta subunit of the RNA polymerase) of Mycobacterium tuberculosis complex, could be useful in selecting potentially resistant mutants. In this study, confirmation of the mutation was performed by sequencing and the results indicated a new mutation S469L (27/96; 28,7%) and mutation S531L (3/96; 3,2%), the latter known to confer rifampicin resistance. One multidrug-resistant strain was detected by Genotype ® MTBDRplus. The mutation S469L was only detected in the Mycobacterium tuberculosis K85 strain, by analysis of sequences corresponding to reference strains from GenBank. Thus, it is not known if it is associated or not to a resistant phenotype or if it is a possible marker of these strains. It would be interesting to perform further DST and genotyping studies on strains with the S469L mutation