Analysis of teashirt mutants affecting cell proliferation in Drosophila melanogaster

Tese de doutoramento, Biologia (Genética), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Drosophila teashirt (tsh) encodes a zinc finger protein essential during Drosophila development. My PhD aimed to clarify the tsh role in cell proliferation studying tsh function in three Drosophila systems: follicle stem cells (FSC), neuroblasts and S2 cells. I found that Tsh and Hh were co-expressed in the Drosophila terminal filament and cap cells. A new tsh female sterile mutation exhibiting early oogenesis arrest allowed me to show that Tsh acts via Hh-mediated signalling pathway to control FSC proliferation; tsh overexpression mimics the hh overexpression associated phenotype. Additionally, in tsh background, the hsGal4 driven expression of tsh or hh partially rescues the abnormal proliferation phenotype allowing oogenesis progression. These results suggest that Tsh is critical to control hh expression contributing for the regulation of FSC proliferation and specification of somatic cell identity. In neuroblasts, hypomorphic tsh mutation leads to a metaphase-like arrest with highly condensed chromosomes associated with apparently normal mitotic spindles and centrosomes. Additionally, checkpoint proteins Bub1 and ROD were localised normally and CID imunodetection excluded an eventual premature sister chromatid separation. Furthermore, cyclin-A appears normally degraded, whereas cyclin-B remains detectable. Double tsh rod and tsh bub1 mutants phenotypes resemble the tsh single mutant. Finally, tsh depletion in S2 cells mimics the tsh mutant phenotype in neuroblasts. These results suggest that Tsh is critical during mitosis progression and I propose that Tsh loss maintains active the spindle checkpoint and/or unable the APC/C activity. We proposed a tsh acts through Hh signalling in cell proliferation. During oogenesis, tsh affects FSC proliferation mediating Hh expression. In neuroblasts, tsh could acts through Hh signalling, since expression of interference hedgehog, a positive mediator of Hh signal, was severely downregulated in microarrays-based analysis.O gene teashirt (tsh) de Drosophila codifica para uma proteína de 116 KD com três motivos atípicos do tipo Zinc finger (Cx2Cx12HMx4H) espaçados. Este gene foi, inicialmente, referido como sendo necessário para a correcta especificação dos segmentos do tronco, durante a embriogénese de Drosphila, em colaboração com os genes Hox. Adicionalmente, em Drosophila, o gene tsh foi implicado na morfogénese do intestino médio, durante o desenvolvimento da parte proximal dos apêndices e durante a especificação dos olhos no adulto. Este trabalho teve como principal objectivo clarificar a função do gene tsh na proliferação celular em Drosophila. Para tal, estudou-se o efeito da perda de função tsh em três contextos celulares de Drosophila: (1) nos ovários, com o intuito de estudar a proliferação das células estaminais foliculares (FSC) do germarium; (2) nos neuroblastos e (3) nas células S2, com o fim de analisar a progressão da mitose propriamente dita. Caracterizou-se as anomalias apresentadas em neuroblastos e ovários de mutantes hipomorficos tsh e em células S2 defectivas para o mesmo gene através da técnica de interferência de RNA (RNAi). A análise do padrão de expressão de cérebros mutantes para tsh foi obtida, utilizando a técnica de microarrays. Durante este trabalho, observou-se que o gene tsh é co-expresso com o gene hedgehog (hh) na extremidade anterior do germário de Drosophila: nas células do filamento terminal (TF) e nas células cap (CC), ambas são localizadas adjacentemente às células estaminais germinais (GSC) e são descritas como parte integrante do nicho das GSC e FSC. Nos ovários de Drosophila, a via de sinalização Hh é essencial para a auto-renovação e proliferação das FSC. Uma nova mutação tsh, causadora da paragem precoce em oogénese (no estado S2/S3), permitiu mostrar que a proteína Tsh regula a expressão dos genes engrailed (en) e hh na extremidade do germário, tornando-se, desta forma, crucial para a normal proliferação das FSC. De acordo com esta observação, as experiências de sobre expressão do gene tsh nos ovários, originaram um fenótipo que se asssemelha ao obtido aquando da sobre expressão do gene hh. As FSC proliferam de forma excessiva, originando um excesso de descendência que se acumula entre as câmaras do ovo, formando as estruturas semelhantes a stalks gigantes. Em adição, nos mutantes defectivos para o tsh, a reposição deste gene, usando o sistema UAS/ hsGal4, permitiu recuperar parcialmente o fenótipo associado à proliferação anormal das FSC, possibilitando a progressão da oogénese até ao estado S5/S6. Consistentemente, a expressão do gene hh através do mesmo sistema UAS/ Gal4, também promoveu uma melhoria do fenótipo nos mutantes tsh, mas de forma menos eficiente. Assim, conclui-se que o Tsh desempenha um papel crítico na regulação da expressão do hh, contribuindo, desta forma, para a proliferação e especificação da identidade das FSC nos ovários de Drosophila. Estes resultados estão de acordo com as interacções entre o gene tsh e a via de sinalização Hh, previamente descritas em embriões de Drosophila. Infelizmente, os resultados obtidos não permitiram concluir se o Tsh actua directamente na regulação da expressão dos genes hh e en, ou se por outro lado, se trata de uma regulação indirecta. Mais, continua por se clarificar, neste caso, se o gene tsh actua como um repressor ou um activador. Recentemente, o gene tiptop (tio) foi descrito como sendo um novo membro da família tsh em Drosophila. Tio codifica para uma proteína de 1024 amino ácidos, a qual apresenta um quarto motivo, tipo zinc finger na região C-terminal. Durante a embriogénese, foi demonstrado que os dois membros da família tsh em Drosophila se reprimem mutuamente. Durante a oogénese, observou-se uma complementaridade na expressão de tsh e tio nas TF: Tio localiza-se nas TF apicais, enquanto o Tsh é preferencialmente detectado nas TF proximais. No entanto, a expressão de tio é ectópica em todas as celulas do TF em ovários Δ126/tshA3-2-66, assim como a expressão de tsh é generalizasa a todas as TF células em ovários tio473 homozigotas. A expressão de hsGal4>UAS-tioFL permitiu a recuperação do fenótipo dos ovários Δ126/tshA3-2-66, tal como foi acima mencionado para o hsGal4>UAS-tsh13. De forma idêntica, a expressão ectópica de tio induz efeitos similares aos acima descritos para a sobre expressão de tsh, especialmente num contexto mutante para tsh. Desta forma, tal como foi descrito durante a embriogénese, tsh e tio reprimem-se mutuamente na extremidade apical do germário. Sugere-se ainda que Tio desempenha uma função redundante, completamente restituída pela presença de Tsh nos ovários tio473. Durante este trabalho, reuniu-se várias evidências que indicam que o gene Tsh é indispensável para a progressão em mitose. Duas mutações hipomórficas no gene tsh (tshNG1 and tshA3-2-66) causam, em neuroblastos, uma paragem em metaphase, com a maioria das figuras mitóticas exibindo cromossomas altamente condensados e associados a fusos mitóticos aparentemente normais e a centrossomas regulares. A análise dos esfregaços destes neuroblastos, com proteínas específicas do ponto de controlo do fuso (como Bub1 e Rod), revelou a normal localização destas proteínas. A imunomarcação com anticorpos contra a proteína CID (homologa da CENP-A) excluiu a ocorrência da separação prematura de cromatídeos irmãos. Mais ainda, nos neuroblastos parados em mitose, a ciclina A aparece normalmente degradada, enquanto que a a ciclina B continua a ser detectada. Duplos mutantes para tsh rod e tsh bub1 apresentam um fenótipo semelhante ao observado nos mutantes tsh simples. Assim, as mutações rod e bub1 não conseguem ultrapassar a forte paragem imposta pela perda de função tsh, continuando inibida a progressão para anáfase. Um papel geral para o Tsh é desconhecido, considerando o seu padrão de expressão localizado no sistema nervoso central (CNS) e as suas bem documentadas funções durante a especificação de estruturas particulares. No entanto, não foi identificado nenhum tipo de regionalização específica dos defeitos mitóticos no CNS. Além disso, o silenciamento do gene tsh em células S2 pela técnica de RNAi provoca uma paragem em mitose, imitando o fenótipo descrito em neuroblastos mutantes para o tsh. Durante as experiências de RNAi, a maioria das células pararam numa configuração semelhante à metafase, o que originou um incrível aumento no índice mitótico. Assim, estes resultados levam a propor que o gene tsh desempenha um papel indispensável na transição metafase/anafase, uma vez que na ausência deste gene, o ponto de controlo do fuso e/ou a actividade do complexo promotor da anafase/ ciclossoma (APC/C) são pertubados. A análise do padrão de expressão de cérebros mutantes para tsh, comparativamente ao selvagem, não permitiu identificar um óbvio gene mitótico alvo. Curiosamente, foi possível estabelecer uma ligação putativa com a via de sinalização Hh através do interference–hedgehog gene (ihog), o terceiro gene com níveis de downregulation mais significativos. IHog é uma proteína transmembranar intermediária na resposta ao sinal activo de Hh, actuando como amplificador deste sinal upstream do receptor negativo desta via de sinalização: Patched (Ptc). O mecanismo, pelo qual o Hh induz a proliferação, depende do tecido em causa, mas inclui a indução e a regulação de componentes do ciclo celular como o das ciclinas: D1, D2, B1 e E, a Cdc25 e o N-Myc. Teoricamente, a Cdc25 (homóloga do String) pode também ser um alvo do Hh nos neuroblastos, uma vez que, de todos os alvos mitóticos conhecidos para a via Hh, a Cdc25 é o unico que se encontra ligeiramente downregulated nos mutantes tsh. No entanto, o sincronismo de paragem em metafase, observado nos neuroblastos tsh, está mais de acordo com alterações nos níveis de expressão do gene polo (um alvo mitótico com níveis de downregulation idênticos aos registados para a Cdc25). De facto, a observação dos neuroblastos tsh faz lembrar o fenótipo mitótico apresentado por mutantes polo (por exemplo homozigotas para o alelo polo9). No entanto, a redução dos níveis de expressão de polo não é por si só suficiente, para explicar a forte paragem em metafase apresentada pelos mutantes tsh e, por outro lado, o polo nunca foi implicado como sendo um alvo da via Hh. Neste ponto, os resultados aqui expostos falham para identificar um alvo mitótico, no entanto, os significantes níveis de downregulation registados para o iHog sugerem uma interligação entre a forte paragem em mitose e a via de sinalização Hh, fazendo lembrar os resultados observados durante a oogénese. Assim, propõe-se que o gene tsh é necessário para a transcrição do iHog e que este ligando está implicado na modulação da sinalização Hh durante a mitose. Com o trabalho aqui apresentado, pretende-se demonstrar que o gene tsh afecta a proliferação das FSC através da regulação da expressão do en e hh. Em adição, poder-se-á especular que em neuroblastos e células S2, o Tsh poderá também afectar a progressão da mitose através da sinalização Hh, uma vez que, pelo menos em neuroblastos, pela técnica dos microarrys, verificou-se que o gene ihog é o terceiro mais donwregulated. Assim, propõe-se uma nova função para o gene tsh na proliferação celular, através da via de sinalização Hh.SFRH/BD4861/2001 and SFRH/BD/13233/2003 from the POCI 2010 (Fundo Social Europeu_ FSE) approved by Fundação para a Ciência e a Tecnologia (Portugal), and also by the collaboration between the Rui Gomes lab and Laurent Fasano labs (CNRS and the Association pour la Recherche Contre le Cancer and La Ligue, France