Isolamento de genes de resistência a Phytophthora cinnamoni e definição de um protocolo de transformação genética em Castanea sativa

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Castanea sativa pertence à família Fagaceae, tem um importante papel na ecologia, alimentação e economia. C. sativa sofre de uma doença severa, denominada por doença da tinta, causada maioritariamente pelo agente patogénico Phytophthora cinnamomi. A transformação genética surge como uma ferramenta poderosa para o melhoramento de plantas lenhosas como as espécies de castanheiro. No entanto, para obter uma transformação efectiva é necessário estabelecer um bom protocolo de regeneração. Existe também necessidade de conhecimento dos genes envolvidos na tolerância/sensibilidade. De modo a obter um sistema de regeneração eficiente em C. sativa, testaram-se três sistemas diferentes: embriogénese somática, indução de nódulos organogénicos e indução de regeneração directa de rebentos. A indução de regeneração directa teve um resultado positivo, levando à obtenção de regeneração de rebentos em cerca de 30% e 10% dos hipocótilos e dos epicótilos, respectivamente. Seguiu-se a construção do vector de transformação com um gene exógeno de óxido de aleno ciclase, relacionado com a resistência de C. sativa a P. cinnamomi, sob o controlo do promotor de castanheiro, que direcciona a expressão para as zonas de ataque de P. cinnamomi. Foi desenvolvida a transformação genética de explantes de C. sativa com o vector pCambia 1302 portador do gene mgfp5. Não se obtiveram explantes transformados nestes ensaios, mas confirmou-se a adequação de hipocótilos como explante inicial para indução de regeneração. Contribuindo para o conhecimento da resposta de defesa de Castanea a fungos patogénicos, isolaram-se fragmentos de cDNA de Castanea, genes putativos de tolerância a P. cinnamomi: a ORF de uma β- 1,3- glucanase e fragmentos das ORFs de duas isoformas de óxido de aleno ciclase. Assim, este trabalho teve contribuições na obtenção de um sistema de regeneração, na obtenção de um vector de transformação promissor na transmissão de defesa melhorada de Castanea a fungos patogénicos e no isolamento de genes putativos de tolerância.Castanea sativa belongs to the family Fagaceae, with an important role in the ecology, food and economy. C. sativa suffers the most from a severe disease, root rot (ink disease) caused by the Phytophthora cinnamomi. Genetic transformation emerged as a powerful tool for the improvement of woody plants, chestnut included. However, for an effective transformation is necessary to establish a good regeneration protocol. There is also need for knowledge on genes involved in tolerance/sensitivity. To obtain an efficient regeneration system in C. sativa, we tested three different systems: somatic embryogenesis, induction of organogenic nodules and direct regeneration of shoots. The induction of shoot direct regeneration brought interesting results, leading to shoot regeneration in about 30% and 10% of hypocotyl and epicotyl explants, respectively. We proceeded with the construction of a transformation vector with an exogenous gene of allene oxide cyclase, related to the resistance of C. sativa to P. cinnamomi, under the control of a chestnut promoter, which directs the expression to P. cinnamomi infection sites. C. sativa genetic transformation assays with several explant types and using a pCambia 1302 vector were achieved. Explants were not transformed in these assays, but we confirmed that hypocotyls are suitable as initial explants for regeneration. As a contribute to the knowledge of the defense response to fungal pathogens in Castanea, we isolated cDNA fragments, putative genes for tolerance to P. cinnamomi namely a β-1, 3 - glucanase ORFand ORF fragments of two allene oxide cyclase isoforms. This work contributed to the attainment of a regeneration system, a promising vector for Castanea improvement to pathogenic fungi and for the isolation of genes putatively related to fungi tolerance