Non-viral gene delivery to mesenchymal stem cells

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010As células estaminais são células indiferenciadas, capazes de se auto-renovar e de se diferenciar, sob determinadas condições, em células provenientes de linhagens múltiplas. Existem dois tipos principais de células estaminais: embrionárias e adultas. Apesar das células estaminais embrionárias possuirem um maior espectro de diferenciação, problemas éticos relacionados com o manuseamento destas tem substituido o seu uso pelas células adultas. As células estaminais mesenquimais (mesenchymal stem cells- MSC) constituem uma população de células estaminais adultas, que apesar de raras, são facilmente isoladas e cultivadas a partir de diversos tecidos, em particular da medula óssea (bone marrow- BM), possuindo uma elevada capacidade de expansão ex-vivo. Em cultura, estas são células aderentes e fusiformes e identificadas através da presença de marcadores de superfície específicos, tais como CD105, CD73, CD44, CD90, CD71 e Stro-1. As MSC tem vindo a ser alvo de grande interesse cientifico, nos últimos anos, devido às suas características particulares. Em primeiro lugar, são capazes de diferenciar-se numa vasta gama de linhagens celulares: condrócitos (células da cartilagem), osteócitos (células de osso, tendão ou ligamentos), adipócitos (células de gordura) e miócitos (células de músculo). Para além disso, possuem capacidades imunomodulátorias, reduzindo as probabilidades de rejeição em transplantes alogénicos e secretam substâncias bioactivas (actividade trófica) tais como citocinas e factores de crescimento que inibem mecanismos de respostas imunes e promovem o enxerto conjunto com células estaminais hematopoiéticas (hematopoietic stem cells- HSC). Alguns autores sugerem ainda que estas células possuem capacidades migratórias para tecidos danificados ou cancerígenos, após administração intravenosa. Deste modo, as MSC constituem uma excelente e potential ferramenta em áreas como a medicina regenerativa e terapia génica. Recentemente, surgiram diversos estudos que reportam o efeito benéfico das MSC na cura de doenças como a do enxerto contra hospedeiro (graft vs host disease- GvHD) e osteogenesis imperfecta, em crianças, onde se observou uma melhoria na formação e crescimento ósseo após infusão com MSC. As MSC têm sido também transfectadas eficientemente com genes terapêuticos, nomeadamente com BMP-2 (codificante para uma proteína morfogénica óssea) de modo a promover a formação de osso, com interferão-beta para facilitar a entrega da respectíva proteína e como terapia coadjuvante na cura de doenças como o Parkinson ou no tratamento de danos na espinal medula. Consequentemente, é imperativo um conhecimento mais aprofundado das características das MSC assim como da tecnologia necessária à sua manipulação. Nos últimos anos, o uso de metodologias baseadas em vectores virais provou ser uma forma eficiente de transfectar células estaminais. Contudo, estes vectores podem ser patogénicos, podendo despoletar uma resposta imune e inflamatória, assim como induzir mutagénese das células transfectadas. Por outro lado, a entrega de genes através de métodos não virais, incluindo electroporação, lipossomas catiónicos e polímeros biodegradáveis, oferecem uma série de vantagens, tais como uma elevada capacidade de empacotamento, baixa imunogenicidade e, uma maior biosegurança. Estes métodos são geralmente usados para expressão transiente do gene, o que pode ser benéfico em células com um período de vida limitado ou na transfecção de células com genes suicidas de modo a destruir células cancerígenas. Adicionalmente, o facto de as MSC serem dificeis de transfectar torna necessário o desenvolvimento de novas metodologias seguras, que ofereçam uma elevada eficiência de transfecção, sem comprometer a viabilidade celular. O objectivo principal deste estudo foi a optimização de duas técnicas não virais, recentemente desenvolvidas, para transfectar MSC da medula óssea: microporação e magnetofecção. A microporação é um método de electroporação desenvolvido para evitar a elevada mortalidade das células, geralmente causadas por esta. Esta técnica faz uso de uma micropipeta e de um eléctrodo capilar em vez de uma cuvete, eliminando os efeitos negativos causados pela electroporação convencional, como a subida de temperatura, variação de pH e libertação de iões metálicos. Elevados valores de transfecção foram recentemente obtidos com microporação em células estaminais do cordão umbilical e do tecido adiposo (65-83%), mas não há registos de estudos com MSC. No âmbito deste estudo, foram transfectados por microporação, dois plasmídeos de diferentes tamanhos (pVAX e pCEP4), ambos contendo um gene que codifica para uma proteína repórter fluorescente verde (green fluorescent protein-GFP) ou amarela (yellow fluorescent protein– YFP), variando os seguintes parâmetros: voltagem (V), duração do pulso (milisegundos-ms) e número de pulsos. As maiores percentagens de transfecção de MSC (50%) e menor mortalidade celular (90% de recuperação celular e 99% de viabilidade celular) foram obtidas com 1000V, 40ms e 1 pulso, usando 150.000 células e 1 μg do plasmídeo menor (pVAX). Adicionalmente, a expressão do gene manteve-se durante os primeiros 7 dias após transfeccção nos 50%, desaparecendo ao fim de 23 dias. Porém a presença de DNA plasmídico (DNAp), mostrou ser a principal responsável pela diminuição do crescimento celular, em vez do processo de microporação por si só. Estes resultados reforçam a ideia sugerida por outros autores de que o DNAp pode sobrecarregar as células metabolicamente, provocando danos às mesmas. No caso da magnetofecção, o DNA plasmídico forma complexos com partículas magnéticas, que posteriormente são inseridos na célula através do uso de um campo magnético. Esta técnica tem vindo a ser usada com êxito na construcção de matrizes 3D e na melhoria da eficiência de lipossomas catiónicos. Recentemente, foram disponibilizados dois tipos de reagentes de partículas magnéticas: PolyMAG, concebido para ser adicionado apenas ao DNA e CombiMAG desenvolvido para ser usado com outro tipo de reagente de transfecção. Neste contexto, foram usadas diferentes quantidades de PolyMAG para transfectar BM-MSC. No entanto, a baixa expressão transgénica obtida com este reagente levou à substituição pelo CombiMAG. Como tal, usaram-se diferentes quantidades de CombiMAG com dois tipos de reagentes de transfecção, separadamente: lipossomas catiónicos (Lipofectamina™ 2000) e outro com polímeros biodegradáveis (X-fect™). A quantidade de DNAp foi também optimizada para ambos os reagentes usados e a entrada deste para o interior da célula foi observada utilizando microscopia confocal. Os melhores resultados de magnetofecção foram obtidos com 15000 células, 2 μl de lipofectamina, 2 μg de DNAp e usando 0.5 μl de CombiMAG: 80% de viabilidade celular, 27% de transfecção e 40% de recuperação celular. Ao contrário da microporação, a manutenção do transgene na célula observou-se apenas por 7 dias, possivelmente devido ao baixo valor inicial de transfecção. Finalmente, nenhuma das técnicas não virais afectou a manutenção das características imunofenotípicas das BM-MSC, verificadas através da marcação com anticorpos específicos para este tipo de células (CD73 e CD105), e da capacidade de diferenciação em osteoblastos e adipócitos. Comparando as duas técnicas usadas neste trabalho, a microporação provou ser um método mais eficiente e seguro na transfeccção de BM-MSC, sendo necessária uma menor quantidade de pDNA (1 μg). A baixa eficiência observada com magnetofeccção pode ser explicada pela aglomeração observada em microscopia confocal entre lipoplexos (complexo de lipossomas e DNA) e partículas magnéticas, que consequentemente poderá ter evitado a entrada de DNAp na célula e originado as baixas eficiências observadas, tornando necessária a prevenção futura desta mesma aglomeração, nomeadamente através do uso de um tampão salino. Como trabalho futuro, seria interessante avaliar também o número de cópias do plasmídeo nas células através de RT-PCR, a citotoxicidade dos reagentes e partículas recorrendo a testes específicos para detectar necrose (detecção da actividade lactato desidrogenase) e apoptose celular (quantificação de nucleossomas no citoplasma), e substituir o uso de lipossomas catiónicos por um péptido Tat, que por sua vez demonstrou elevadas eficiências em estudos recentes de magnetofecção. Os resultados obtidos sugerem que, em conjunto, a elevada eficiência e fácil uso da microporação na transfecção de BM-MSC, assim como o uso potential da magnetofecção na construção de matrizes 3D, constituiem uma possível feramenta para uso clínico e engenharia genética.Human mesenchymal stem cells (hMSC) are multipotent stem cells, capable of differentiation in vivo and ex-vivo into multiple cell lineages. Additionally, their immunomodulatory properties and trophic activity have made them extremely attractive for tissue engineering and gene therapy. Viral vectors have been used to efficiently genetically modify MSC, but due to safety concerns, non-viral vectors have been presented as a suitable alternative. However, non-viral methods are less efficient to deliver DNA, especially to hard-to-transfect cells as MSC. In this study, gene delivery to human Bone Marrow (BM) MSC was optimized by two novel non-viral techniques: microporation and magnetofection. Microporation is an electroporation based method recently developed to overcome high cell mortality obtained with conventional electroporation. Conversely, magnetofection has proven to be useful in scaffold construction and to improve liposomes effectiveness. High transgene expression (50%) and low cell mortality (90% of cell recovery and 99% of cell viability) was obtained with microporation, when using 150,000 cells and 1μg of plasmid DNA (pDNA) encoding for a reporter protein. Moreover, it was shown that BM-MSC proliferation kinetics was mainly affected by the presence of pDNA rather than due to microporation process. On the contrary, magnetofection achieved high viability (80%) but only 27% of transfection and 40% of cell recovery, when using 15,000 cells/μg DNA. Lower efficiencies were mainly explained by the agglomeration observed in confocal microscopy, between lipoplexes and magnetic particles, which most likely prevented pDNA entry into the cell. Finally, none of the methods affected BM-MSC immunophenotype characteristics and differentiation potential. Taken together, present data suggest that microporation is an easy and highly efficient promising tool for BM-MSC transfection, while magnetofection potential use on 3D tissue construction demands further prevention of particle agglomeration. Each method, with their particular advantage, has undoubtedly a potential use for clinical applications and genetic engineering