Methylglyoxal metabolism in Leishmania infantum

Tese de doutoramento, Bioquímica (Regulação Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010.Leishmaniasis, caused by a Leishmania parasite belonging to the Trypanosomatidae family, are diseases affecting humans and other mammals. The most severe form of the disease is lethal if untreated, currently existing no vaccines or efficient therapies. The identification of new therapeutic targets is presently based on exploiting the biochemical differences between the parasite and the host. One of the main biochemical characteristics distinguishing trypanosomatids from other eukaryotic cells is the functional replacement of glutathione by trypanothione. In trypanosomatids, the glyoxalase system, comprising the enzymes glyoxalase I and glyoxalase II, depends on trypanothione to eliminate methylglyoxal, a toxic compound formed non-enzymatically during glycolysis. Hence, this is an excellent model system to understand trypanothione-dependent enzymes specificity at a kinetic and molecular level. The methylglyoxal metabolism in L. infantum study would not be complete without an account of aldose reductase, a NADPH-dependent enzyme also catabolising this toxic compound. This project includes an eclectic structural and biochemical study of the main enzymes involved in methylglyoxal catabolism, contributing for the knowledge of these complex parasites. Additionally, these enzymes’ activities complement each other in such a way that they can be synergistically exploited in the quest for new anti-leishmanial drug targets. The glyoxalase I gene from Leishmania infantum (LiGLO1) was isolated and cloned into an expression vector for bacteria. The recombinant protein was over-expressed in E. coli, purified and kinetically characterised. LiGLO1 showed to preferentially use the hemithioacetal derived from trypanothione, although it can also catalyse the same reaction with the glutathione-derived hemithioacetal. The recombinant protein was crystallised and its structure solved by molecular replacement, using the glyoxalase structure from L. major as a search model. Although the LiGLO1 structure is very similar to the L. major GLO1, as expected by its high homology, the metal observed at the active site is different. While LmGLO1 requires nickel for its activity, like glyoxalase I from prokaryotes, it was shown both by ICP and anomalous diffraction that LiGLO1 contains zinc in the active site, as its eukaryotic homologues. On the other hand, LiGLO1 has significant structural differences relatively to the human glyoxalase I enzyme. The glyoxalase II gene from L. infantum (LiGLO2) was also isolated and cloned in a bacterial expression vector. The recombinant protein was over-expressed in E. coli, purified and kinetically characterised, confirming its specificity towards trypanothione-derived thiolesters. LiGLO2 was crystallised and its structure solved by molecular replacement, using the glutathione-dependent human glyoxalase II structure as a search model, for its high sequence homology with the structurally unknown L. infantum protein. The determined structural model for LiGLO2 is very similar to its human counterpart. Highly conserved residues were identified in the active site, as well as specific residues of the L. infantum enzyme, being noteworthy the presence of the spermidine-binding Cys294 and Ile171, both absent from the human enzyme. The presence of a spermidine molecule on the LiGLO2 substrate binding site, together with sequence analysis, clarified the enzyme’s substrate specificity at a molecular level. Both ICP metal-analysis and the B factor values for the metal atoms revealed the presence of zinc and/or iron in the enzyme active site. A structure with D-lactate in the active site was obtained by crystal soaking with substrate. Superimposing both LiGLO2 structures, the localization of the trypanothione-derived thiolester in the substrate-binding site could be clearly inferred. Two of the residues forming the substrate- binding pocket, Tyr291 and Cys294, were subsequently replaced by the S-D-lactoylglutathione- binding residues found on the human enzyme, Arg249 and Lys252, respectively. Recombinant mutated LiGLO2 was over-expressed in E. coli. Kinetic analysis revealed that the enzyme’s substrate specificity was changed, catalysing the reaction with S-D-lactoylglutathione, and loosing affinity towards S-D-lactoyltrypanothione. These results show that the mutated residues are critical for the enzyme specificity. The aldose reductase gene from L. infantum (LiAKR) was identified for the first time in a trypanosomatid. It was isolated and cloned into an expression vector. Over-expression of the soluble recombinant protein in E. coli was only achieved by co-expression with chaperone systems. The LiAKR enzyme was kinetically characterised as a NADPH-dependent aldose reductase involved in the catabolism of methylglyoxal. This protein was recently crystallised, although the observed diffraction requires crystal optimization.Leishmanioses são doenças que afectam humanos e outros mamíferos, provocadas por um parasita do género Leishmania, pertencente à família Trypanosomatidae. A forma mais severa da doença é letal se não for tratada, não existindo actualmente vacinas ou terapias curativas eficazes. A identificação de novos alvos terapêuticos baseia-se em diferenças encontradas entre o parasita e o hospedeiro. Uma das principais características bioquímicas que distingue os tripanossomatídeos de outras células eucariotas é a substituição funcional de glutationo por tripanotiono. Em tripanossomatídeos, o sistema dos glioxalases, constituído pelos enzimas glioxalase I e glioxalase II, depende de tripanotiono para eliminar o metilglioxal, um composto tóxico formado nãoenzimaticamente durante a glicólise. Assim, este é um excelente sistema modelo para compreender a especificidade de enzimas dependentes de tripanotiono a um nível cinético e molecular. No entanto, o estudo do metabolismo do metilglioxal em L. infantum não estaria completo sem referir o aldose redutase, um enzima dependente de NADPH que também catabolisa este composto tóxico. Este projecto inclui um estudo estrutural e bioquímico eclético dos principais enzimas envolvidos no catabolismo do metilglioxal, contribuindo para o estudo destes complexos parasitas. Para além disso, as actividades destes enzimas são de tal modo complementares que podem ser exploradas sinergisticamente na busca por novos alvos para fármacos anti-leishmania. O gene do glioxalase I de Leishmania infantum foi isolado e clonado num vector de expressão. A proteína recombinante foi sobre-expressa em E. coli, purificada e caracterizada cineticamente, verificando-se que o LiGLO1 catalisa preferencialmente o hemitioacetal derivado de tripanotiono, embora também possa utilizar o hemitioacetal derivado de glutationo. A proteína recombinante foi cristalizada e a sua estrutura resolvida por substituição molecular, utilizando a estrutura do glioxalase I de L. major como modelo de pesquisa. Embora a estrutura do LiGLO1 seja muito semelhante à do LmGLO1, como esperado pela sua elevada homologia de 97 %, estes enzimas diveregem no metal presente no centro activo. Enquanto o LmGLO1 requer níquel para a sua actividade, à semelhança dos glioxalases I de procariotas, foi verificado tanto por ICP como por difracção anómala, que o LiGLO1 contém zinco no seu centro activo, à semelhança dos seus homólogos eucariotas. Estes resultados permitiram-nos estabelecer uma diferença entre ambas as espécies de Leishmania, e propor uma hipótese em que o enzima de L. infantum terá divergido dos procariotas mais cedo na linha evolutiva do que o enzima de L. major. Por outro lado, LiGLO1 tem grandes diferenças estruturais em relação ao homólogo humano. O glioxalase II de L. infantum foi também isolado e clonado num vector de expressão. A proteína recombinante foi sobre-expressa em E. coli, purificada e caracterizada cineticamente, confirmando-se a sua especificidade para os tioésteres derivados de tripanotiono. LiGLO2 foi cristalizado e a sua estrutura resolvida por substituição molecular, utilizando a estrutura do glioxalase II humano, dependente de glutationo, como modelo de pesquisa. O modelo da estrutura determinado para o LiGLO2 é muito semelhante ao do seu homólogo humano. Foram identificados resíduos conservados no centro activo (His76, His78, Asp80, His81, His139, Asp164, His210) bem como resíduos específicos no enzima de L. infantum (dos quais é de salientar a presença da Cys294 e Ile171, que ligam a espermidina e a ausência dos resíduos Arg249, Lys143 e Lys252, existentes no enzima humano). A presença de uma molécula de espermidina no local de ligação ao substrato do LiGLO2, juntamente com uma análise das sequências, elucidou a especificidade do substrato do enzima ao nível molecular. Tanto a análise de metais por ICP, como os valores dos factores B dos átomos de metal, revelaram a presença de zinco e/ou ferro no centro activo do enzima. Foi obtido um modelo estrutural deste enzima com D-lactato no centro activo, através de soaking de cristais com substrato. Sobrepondo ambas as estruturas do LiGLO2, pôde ser claramente inferida a localização do tioester derivado de tripanotiono no centro de ligação ao substrato. Dois dos resíduos que formam a cavidade onde se liga o substrato, Tyr291 e Cys294, foram subsequentemente substituídos por resíduos que ligam o S-D-lactoilglutationo no enzima humano, Arg249 e Lys252, respectivamente. O LiGLO2 mutado recombiante foi sobre-expresso em E. coli. Este enzima mutado foi instável durante o processo de purificação. Análise cinética revelou que a especificidade do enzima para o substrato foi alterada, reagindo com S-D-lactoilglutationo e perdendo actividade para o S-D-lactoiltripanotiono. Estes resultados mostram que os resíduos mutados são críticos para a especificidade do enzima. O gene do aldose redutase de L. infantum foi identificado pela primeira vez num tripanossomatídeo. Foi isolado e clonado num vector de expressão. A sobre-expressão da proteína recombinante na fracção solúvel em E. coli foi apenas conseguida por co-expressão com sistemas de chaperones. O enzima LiAKR foi cineticamente caracterizado como um aldose redutase dependente de NADPH envolvido no catabolism do metilglioxal. Esta proteína foi recentemente cristalizada, embora a difracção observada requeira optimização dos cristais.Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), SFRH/BD/28691/2006; European Molecular Biology Organization (EMBO