Technical improvements for analysis of recalcitrant proteins by LC-MS : the mycorrhiza responsive membrane proteome as a case study

Arbuscular mycorrhizas (AM) are widespread symbiotic associations between plant roots and AM fungi. Deep membrane alterations are the foremost morphological changes occurring in the host plant in response to AM symbiosis. Two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) is the workhorse method in AM proteomics. Membrane proteins are under-represented in 2-DE because of their hydrophobicity, low abundance, and precipitation at their isoelectric point, thereby few are the identified membrane proteins involved in sustaining the AM symbiosis. Membrane proteomics is still challenging due to 2-DE related shortcomings, however latest trends and advancements in mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics offer enormous potential to monitor membrane protein change in abundance in large scale experiments. In the current work microsomal proteins of Medicago truncatula roots inoculated with Rhizophagus irregularis were, for the first time, scrutinised by state-of-the-art MS-based proteomic approaches iTRAQ-OFFGEL-LC-MS/MS and label-free 1-DE-LC-MS/MS. The applied workflows combine two novel proteomic procedures, label-based and -free, targeting an insight view on the membrane proteome changes in AM symbiosis. A subcellular fractionation method is herein described to access the total membrane-associated proteins with sufficient recovery and purity for their subsequent in-depth analysis. In addition to the biological gain by shedding the light on candidate AM-related membrane proteins, a methodological approach was carried out in the present work in order to elucidate the iTRAQ labelling impact on peptide isoelectric pointsLa symbiose mycorhizienne à arbuscules (SMA) est le résultat de l'interaction entre les racines de plus de 80% des familles de plantes terrestres et les champignons MA. Divers types de membranes jouent un rôle crucial dans la mise en place et le fonctionnement de la SMA chez l’hôte végétal. Si l’électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) reste la méthode la plus couramment utilisée pour des analyses protéomiques quantitatives dans la SMA, elle résout difficilement les protéines membranaires en raison de leur hydrophobicité, leur précipitation au point isoélectrique (pI) et leur faible abondance comparativement aux protéines cytosoliques. Donc, peu nombreuses sont les protéines membranaires identifiées comme étant régulées en réponse à la symbiose. Afin d’avoir accès à cette catégorie de protéines et contourner les défauts de la 2-DE, l’application de nouvelles méthodes permet de réaliser des analyses quantitatives avec marquage chimique (comme l’iTRAQ) ou non (label-free). Dans ce contexte, deux méthodes de protéomique quantitative, iTRAQ-OFFGEL-CL-SM/SM et « label-free » 1-DE-CL-SM/SM, sont adoptées dans ce travail visant à identifier et quantifier les variations d’accumulation des protéines microsomales de racines de Medicago truncatula inoculées par Rhizophagus irregularis, préalable indispensable à l’analyse de leur rôle fonctionnel dans la SMA. Un protocole d’extraction donnant accès à des fractions radiculaires enrichies en protéines microsomales nécessaires pour les analyses ultérieures est décrit dans cette étude. En plus de l’analyse quantitative du protéome membranaire en réponse à la SMA, une approche méthodologique a été mise en place afin d’étudier l’impact du marquage iTRAQ sur le pI des peptide