Development of collagen/nanohydroxyapatite scaffolds containing plant extract for bone regeneration

A engenharia de tecido ósseo busca o desenvolvimento de matrizes que tenham composição, nanoestrutura e resposta biológica semelhante ao tecido ósseo natural. Sendo o osso composto por colágeno do tipo I, a proteína fibrosa mais abundante do corpo humano, e hidroxiapatita, uma biocerâmica com propriedades bioativas e osteocondutoras, foram preparadas matrizes utilizando esses biomateriais afim de se obter um material poroso com potencialidade de uso como agente de reconstrução de tecido ósseo. O colágeno aniônico (C) foi obtido a partir da hidrolise alcalina da serosa porcina e a nanohidroxiapatita (nHA) foi sintetizada a partir de brometo de cetrimônio, K2HPO4 e CaCl2.  Extratos de semente de uva (P), casca de romã (R) e casca de jabuticaba (J) foram utilizados como fonte de flavonoides, que apresentam propriedades bactericidas, antioxidantes, anti-inflamatórias e capacidade de ser utilizado como agente reticulante. Assim, foram preparadas oito matrizes denominadas C, CP, CR, CJ, CnHA, CnHAP, CnHAR e CnHAJ, caracterizadas por DSC (calorimetria exploratória diferencial), para se avaliar a temperatura de desnaturação do colágeno, MEV (microscopia eletrônica de varredura), ensaios de porosidade por imersão em etanol, cinética de absorção de tampão fosfato salino (PBS), degradação via colagenase e ensaios de atividade antimicrobiana e citotoxicidade. O colágeno foi caracterizado por DSC e por espectroscopia na região do infravermelho (FTIR), a nanohidroxiapatita por espectroscopia de energia dispersiva de raios X (EDX) para se avaliar a razão Ca/P, por MEV, por difração de raios-X (DRX), FTIR e ensaios de citotoxicidade. Os extratos por análises de FTIR e foram caracterizados frente sua citotoxicidade, ação e concentração de flavonoides totais por espectroscopia na região ultravioleta-visível (Uv-vis). A partir disso, observou-se que o extrato de semente de uva apresentou a menor concentração bactericida mínima, sendo de 250 µg mL-1 e os três extratos atuaram como agentes reticulantes do biopolímero, aumentando sua resistência enzimática e estabilidade térmica. Foi obtida a hidroxiapatita dentro da escala nanométrica e com razão Ca/P igual a 1,60 ± 0,03. Em relação a atividade antimicrobiana apenas a matriz CR apresentou atividade e, dentro da faixa de concentrações testadas, os extratos apresentaram citotoxicidade e a nanohidroxiapatita um aumento na viabilidade celular. As matrizes apresentaram porosidade e tamanho de poros adequados para crescimento ósseo, sendo que em períodos de 24 h apresentam viabilidade celular superior a 70% e em períodos de 48 h as matrizes CR, CnHAP, CnHAR e CnHAJ apresentaram citotoxicidade. Até o momento, conclui-se que apenas as matrizes C, CP, CJ e CnHA poderiam ser utilizadas como biomaterial para regeneração de tecido ósseo, podendo ser utilizadas para a etapa in vivo.Bone tissue engineering aims the development of scaffolds that have composition, nanostructure and biological response similar to natural bone tissue. Once bone is composed of type I collagen, the most abundant fibrous protein in the human body and hydroxyapatite, a bioceramic with bioactive and osteoconductive properties, scaffolds were prepared using these biomaterials in order to obtain a porous material with potential for reconstruction of bone tissue. Anionic collagen (C) was obtained from alkaline hydrolysis of serous porcine and nanohydroxyapatite (nHA) was synthesized from cetrimonium bromide, K2HPO4 and CaCl2. Grape seed extracts (P), pomegranate peel extract (R) and jabuticaba peel extract (J) were used as a source of flavonoids, which have bactericidal, antioxidant, anti-inflammatory properties and ability to be used as crosslinker. Thus, eight scaffolds named C, CP, CR, CJ, CnHA, CnHAP, CnHAR and CnHAJ were prepared and characterized by DSC (differential exploratory calorimetry) to evaluate collagen denaturation temperature, SEM (scanning electron microscopy), ethanol immersion porosity assays, saline phosphate buffer (PBS) absorption kinetics, collagenase degradation assays, antimicrobial activity and cytotoxicity assays. Collagen was characterized by DSC and infrared spectroscopy (FTIR), nanohydroxyapatite by energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDX) to evaluate the Ca/P ratio, by SEM, by X-ray diffraction (XRD), FTIR and cytotoxicity assays. The extracts were analyzed by FTIR, cytotoxicity assay and total flavonoids concentration by ultraviolet-visible spectroscopy (Uv-vis). It was observed that the grape seed extract presented the lowest minimum bactericidal concentration, being 250 µg mL-1 and the three extracts acted as biopolymer crosslinking agents, increasing its enzymatic resistance and thermal stability. Hydroxyapatite was obtained within the nanometer scale and Ca/P ratio equal to 1.60 ± 0.03. Only CR scaffold presented antimicrobial activity and all extracts showed cytotoxicity at the concentrations tested, while nanohydroxyapatite increased cell viability. The scaffolds presented porosity and pore size appropriate for bone growth. After 24 h of incubation, they presented high cell viability (more than 70%) and after 48 h the CR, CnHAP, CnHAR and CnHAJ presented cytotoxicity. It can be concluded that only matrices C, CP, CJ and CnHA could be used as biomaterial for bone tissue regeneration and for the in vivo tests step