Untersuchungen zur Entstehung von reaktiven Sauerstoffspezies in Parodontalligament-Fibroblasten

Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Entstehung und den Auswirkungen von oxidativem Stress in den Zellen des parodontalen Ligaments (PDL). Der Begriff Oxidativer Stress beschreibt dabei eine potenziell schädliche Stoffwechsellage, bei der auf Grund einer gesteigerten Bildung von oxidativ wirksamen Molekülen (reaktive Sauerstoffspezies, ROS) ein gestörtes Verhältnis zwischen Oxidantien und Antioxidantien vorliegt. Es wurden in-vitro-Experimente durchgeführt, in denen zunächst eine mögliche Freisetzung von ROS überprüft wurde. Hierdurch sollte die Fragestellung geklärt werden, ob durch bestimmte Faktoren, wie sie auch bei Parodontitis und kieferorthopädischer Zahnbewegung auftreten, überhaupt oxidativer Stress in den Zellverbünden der PDL-Fibroblasten auftritt. Im zweiten Teil der Arbeit sollten durch weitere Versuche die Auswirkungen eines ebensolchen ROS-Anstiegs auf den Zellstoffwechsel ergründet werden, indem wir die Fibroblasten direkt mittels ROS (H2O2) stimulierten, worauf die Aktivität der am Knochenstoffwechsel beteiligten Gene für IL-6, IL-8 und COX-2 gemessen wurde. Die verwendeten PDL-Zellen wurden aus Weisheitszähnen von Patienten im Alter von 14-22 Jahren isoliert, wobei darauf geachtet wurde, dass es sich um karies- und entzündungsfreie Zähne handelte, deren Entfernung medizinisch indiziert war. Nachdem die gewonnen Zellen über spezifische Markergene identifiziert worden waren, erfolgten ihre Kultivierung und die jeweiligen Versuche. Im ersten Teil fand eine Behandlung durch Druck (2g/cm²; 24 h), Hypoxie (48 h) und Lysate der parodontalpathogenen Bakterienspezies A. actinomycetemcomitans und P. gingivalis (12 h und 96 h) statt, wobei stets auch unbehandelte Kontrollen angelegt wurden. Daraufhin wurde eine Fluoreszenzfärbung der Proben mit dem Farbstoff DCFH-DA (Dichlorodihydrofluorescein diacetate) durchgeführt, worauf die Zellen mittels fluoreszenzaktivierter Durchflusszytometrie (Fluorescence activated cell sorting, FACS) vermessen werden konnten. Wir fanden in den durch Druck und Hypoxie behandelten Proben in Relation zu den Kontrollen signifikant erhöhte ROS-Konzentrationen. Nach der Reizung durch Bakterienlysate zeigten sich hingegen allenfalls Tendenzen eines Anstiegs, die aber statistisch nicht signifikant waren. Begleitend wurde auch die Zellüberlebensrate in den Populationen untersucht, es kam dabei zu ähnlichen Ergebnissen. Sie sank nach Stimulation durch Druck und Hypoxie signifikant, im Fall der Bakterienlysate erhielten wir auch hier keine aussagekräftigen Veränderungen. Im zweiten Teil sollten die Auswirkungen von ROS auf den Zellstoffwechsel beleuchtet werden. Dafür wurde nach Vorversuchen eine H2O2-Konzentration von 0,1 mM als geeignet befunden, der die Zellen anschließend über einen Zeitraum von 2 h ausgesetzt wurden. Die Messung der Genexpression erfolgte mittels RT-qPCR. Es fanden sich dabei für alle untersuchten Gene (IL-6, IL-8, COX-2) erhöhte Expressionsraten. Ein weiterer Bestandteil der Arbeit lag in der Ergründung der Auswirkungen des Antioxidantiums N-Acetylcystein (NAC). Hierfür wurden innerhalb der Experimentreihe mit P. gingivalis auch Proben mit dieser Substanz versetzt, was zu einem signifikanten Rückgang der jeweiligen ROS-Konzentrationen führte. Analoge Ergebnisse fanden wir bei der Stimulation durch H2O2, nach der es ebenfalls zu einem Abfall der Expressionsraten für alle Gene kam, wenn die Zellen gleichzeitig mit NAC behandelt worden waren. Die gefundenen Ergebnisse weisen einerseits darauf hin, dass bestimmte Reize, die während Parodontitis und kieferorthopädischer Zahnbewegung auftreten, in der Lage sind, oxidativen Stress in den Zellen des PDL auszulösen. Andererseits zeigte sich aber auch die Bedeutung gerade der ROS in der Reizantwort und der Signalweitergabe. Weiter lieferten die Untersuchungen Hinweise darauf, dass durch die Verwendung von Antioxidantien neue vielfältige Therapieansätze entstehen könnten. Mit diesen wäre es in Zukunft eventuell möglich, gerade komplexe Patientenfälle, bei denen eine Kombination aus Parodontitis und kieferorthopädischem Behandlungswunsch vorliegt, sicherer und vorhersagbarer zu behandeln