Microenvironment-dependent phenotypes of human macrophages

Makrophagen sind ein essentieller Teil der angeborenen Immunabwehr. Hierbei sind sie verantwortlich für die Erkennung und Phagozytose von Bakterien. Zusätzlich führen Gewebemakrophagen viele homöostatische Funktionen aus, die vom jeweiligen Gewebe abhängen. Dadurch sind sie häufig involviert in der Entstehung und Progression von Krankheiten, wie zum Beispiel in Tumoren, Arthritis, Präeklampsie und Asthma. Außerdem können Makrophagen durch die Vielzahl an exprimierten Rezeptoren auf ihrer Oberfläche, kleinste Veränderungen in ihrer Umgebung wahrnehmen und darauf mit einem veränderten Phänotyp reagieren. Eine Untersuchung der möglichen Veränderungen der Zellen könnte helfen, ihren Beitrag zu verschiedenen Krankheiten besser zu verstehen und neue therapeutische Möglichkeiten zu eröffnen. Dementsprechend wurden in dieser Arbeit Monozyten aus dem periphären Blut von gesunden Spendern in verschiedenen Konditionen zu Makrophagen differenziert. Um die resultierenden Makrophagen eingehend zu studieren wurde ihr Transkriptom mittels RNA Sequenzierung und die offene Chromatinstruktur mit ATAC-seq analysiert. Von allen analysierten Konditionen, hatte Kollagen den gr ̈oßten Einfluss auf die Zellen. Es induzierte Gene, die mit der Komplement Kaskade, Chemotaxis und der Endozytose assoziiert sind, wohingegen es inflammatorische Gene und Gene der Extrazellulären Matrix inhibierte. Um mehr über die Regulatoren, die hinter diesen Unterschieden in der Genexpression stehen, zu erfahren, haben wir das offene Chromatin der Zellen analysiert. Kollagen-spezifische zugängliche Regionen waren angereichert für ETS, ETS:IRF, NFAT und MAF Motive. Da Kollagen-Makrophagen eine signifikant erhöhte Expression von MAF, IRF4, ETS2 und NFATC2 aufwiesen, wurden diese als mögliche Kandidaten weiter analysiert. Mit Hilfe von ChIP-seq Daten für c-MAF und so genannten Footprint Analysen der restlichen Motive, konnten wir leider keinen der Faktoren als Verantwortlichen für die Genexpressionsunterschiede identifizieren. Allerdings k ̈onnten nicht nur induzierte, sondern auch inhibierte Faktoren für die Regulation der Genexpression verantwortlich sein. Zwei Transkriptionsfaktoren, Dec2 und EGR2, k ̈amen dafu ̈r in Frage, da sie in Kollagen-Makrophagen nicht exprimiert wurden. Da die Bindungssequenzen der Faktoren im Standardmakrophagen spezifisch offenen Chromatin angereichert waren, analysierten wir die Bindungseigenschaften der beiden Faktoren mittels ChIP-seq. Dabei konnten wir zeigen, das sie diese Regionen im Chromatin binden und somit in der Regulation von Genen w ̈ahrend der Differenzierung eine Rolle spielen könnten. Um die Auswirkung der reduzierten Expression dieser zuletzt genannten Transkriptionsfaktoren weiter zu untersuchen, wurden Knock-Down Experimente für beide in humanen Monozyten durchgeführt. Reduktion des Dec-2 Levels zeigte lediglich einen geringeren Effekt auf den Phänotyp von Makrophagen, wohingegen der Verlust von EGR2 einen stärkeren Einfluss zeigte. EGR2 knock down Makrophagen wiesen eine ähnliche Morphologie wie Kollagen-Makrophagen auf. Des weiteren zeigten sie ebenfalls reduzierte Expression von Makrophagen spezifischen Genen, zum Beispiel CSF1 und CHI3L1. Daraus lässt sich schließen, dass EGR2 während der Differenzierung notwendig ist um Makrophagen spezifische Gene zu aktivieren. In der Analyse des aktiven Chromatins nach EGR2 knock down fanden wir ebenfalls eine hohe Ähnlichkeit zwischen den mit Kollagen behandelten Makrophagen und den EGR2 Knock Down Zellen. Im Vergleich mit Plastik-Makrophagen zeigten beide eine verringerte Zugänglichkeit in speziellen Chromatin Regionen. Dies deutet darauf hin, dass die Induktion von EGR2, durch die Adhäsion der Zellen auf Plastik, notwendig ist für eine Öffnung des Chromatins und der Expression vieler Makrophagen spezifischer Gene. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Transkriptom und die Chromatinlandschaft von CD163 positiv sortierten Hofbauer Zellen analysiert. Mittels RNA Sequenzierung konnten wir zeigen, dass sie eine erhöhte Expression von Wachstumsfaktoren, zum Beispiel VEGFA oder M-CSF, aufweisen. Im Gegensatz dazu inhibieren Hofbauer Zellen Gene, die mit Immunabwehr und der viralen Abwehr zusammenhängen. Interessanterweise exprimierten Kollagen-Makrophagen und Hofbauer Zellen zum Teil ähnliche Gene, diese umfassten unter anderem den Komplement C1q Komplex und CD163, was darauf hinweist das die Interaktion mit Kollagen auch in residenten Gewebemakrophagen eine Rolle spielt. Um Kandidaten für die Regulation der Genexpression zu entdecken, analysierten wir die Motiv Signatur des offenen Chromatins in Hofbauer Zellen, wobei wir eine Anreicherung von ETS, bZIP, MAF und NR4A1 Motiven entdeckten. Da die Transkriptionsfaktoren MAF und NR4A1 in Hofbauer Zellen stark exprimiert waren, k ̈onnten sie verantwortlich sein für die beschriebenen Expressionsmuster. Zusammenfassend konnten wir feststellen, dass Hofbauer Zellen essentiell fu ̈r die korrekte Entwicklung der Plazenta sind. Dabei weisen sie ein anti-inflammatorischen Phänotyp auf, der für die Toleranz der Mutter zum Fötus eine wichtige Rolle spielt. Darüberhinaus exprimieren sie aber auch viele Rezeptoren, welche verantwortlich für die Erkennung von Pathogenen sind. Dies deutet darauf hin, dass diese Makrophagen auch in der Lage sind eine inflammatorische Reaktion einzuleiten. Des weiteren haben wir zwei Transkriptionsfaktoren, MAF und NR4A1, gefunden, die möglicherweise für die Regulation der Genexpression verantwortlich sein könnten