Prognostic value of specific target genes in papillary renal cell carcinoma

Hintergründe und Ziele Das Nierenzellkarzinom zählt mit einer Inzidenz von schätzungsweise 338 000 Neuerkrankungen pro Jahr zu den häufigsten Krebserkrankungen weltweit. Dessen zweithäufigster histopathologischer Subtyp, das papilläre Nierenzellkarzinom, umfasst einerseits langsam wachsende Neoplasien mit multifokalem Auftreten (Subtyp 1), andererseits aber auch aggressivere, schnell fortschreitende Tumore (Subtyp 2) mit einer deutlich schlechteren Prognose. Bislang ist die prognostisch relevante Unterteilung in diese Subtypen nur klinisch-pathologisch nach morphologischen Gesichtspunkten etabliert, sodass eine verlässlichere Methode zur Unterscheidung anzustreben ist. Auf micro-RNA-Ebene sowie molekulargenetisch zeigten sich bereits Unterschiede, die unter anderem den c-Myc-Signalweg betreffen. In seiner Funktion als Transkriptionsfaktor reguliert c-Myc nach aktueller Studienlage die Expression von 15 % aller Gene und spielt aufgrund seiner proliferationsfördernden und somit onkogenen Wirkung bei vielen Tumorerkrankungen eine wichtige Rolle in der Karzinogenese. In wieweit die Dysregulation c-Mycs für die Entstehung der Subtypen des papillären Nierenzellkarzinoms relevant ist und ob sich das c-Myc-Expressionslevel zwischen den Subtypen unterschiedet, ist bislang nicht ausreichend untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher c-Myc und das hiervon abhängige, proliferationsfördernde Protein MINA-53 hinsichtlich ihrer Expression im Tumorgewebe immunhistochemisch untersucht. Färbungen mit einem Antikörper gegen den etablierten Proliferationsmarker Ki-67 erfolgten im Vorfeld. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es darzustellen, in wieweit die immunhistochemischen Marker c-Myc, MINA53 und Ki-67 zusätzlichen Nutzen hinsichtlich der Vorhersage des Langzeitüberlebens der Patienten erbringen können. Methoden Im Rahmen des deutschen, multizentrischen PANZAR-Konsortiums wurden die klinischen und histopathologischen Daten zu Patienten mit einem zwischen 1990 und 2007 diagnostizierten, papillären Nierenzellkarzinom zusammengetragen. Die pathologische Evaluierung der Gewebeproben erfolgte einheitlich unter Bestimmung der jeweiligen Tumor-Subtypen. So konnten im Rahmen dieser Arbeit 339 Tumorschnitte mit entsprechenden klinischen Daten mithilfe immunhistochemischer Färbungen analysiert werden. Entsprechende Gewebe-Mikroarrays wurden immunhistochemisch mit den Antikörpern gegen die Proteine c-Myc und MINA53 gefärbt und unter dem Mikroskop ausgewertet. Für die c-Myc- und die MINA53-Färbungen erfolgte die Auswertung nach dem Anteil gefärbter Tumorzellen an allen sichtbaren Tumorzellen sowie nach deren Färbeintensität. Im Anschluss erfolgte eine statistische Analyse der Daten mittels SPSS. Hierbei ist auch das Ergebnis einer Ki-67-Färbung, die zum Vergleich mit den Biomarkern verwendet werde, in die statistischen Analysen miteingeflossen. Ergebnisse und Beobachtungen Bei der Auswertung der klinischen sowie der Überlebensdaten zeigte sich ein deutlich schlechteres, tumorspezifisches Überleben der Typ-2-Patienten im Vergleich zu den Typ-1-Patienten (Mittelwerte 97,3 Monate vs. 163,5 Monate; p = 0,001) sowie signifikant ungünstigere Ergebnisse für die klinischen Parameter Grading (p < 0,001), Staging nach dem TNM-System (p < 0,001), Invasivität (p < 0,001) und Lymphknoten- und Fernmetastasierungsrate (p < 0,001) für den Subtyp 2. Unsere immunhistochemischen Auswertungen erbrachten eine signifikant stärkere c-Myc- Färbung des Tumorgewebes im Vergleich zum Normalgewebe (p = 0,001), eine Unterscheidung der zwei Subtypen aufgrund des c-Myc-Färbeverhaltens war auf signifikantem Niveau nicht möglich (p = 0,221). In unseren Überlebensanalysen war der prozentuale Anteil der c-Myc-gefärbten Zellen, unabhängig von ihrer Färbeintensität, in Verbindung mit den Subtypen mit einer signifikant schlechteren Prognose assoziiert (p < 0,001). Eine weitere Unterteilung der Subtypen nach schwacher, mittelstarker oder starker c-Myc-Färbungsintensität, welche anhand eines in der Routine praktikablen Scoring-Systems erhoben wurde, erbrachte ebenfalls signifikante Ergebnisse: Eine fehlende oder eine starke c-Myc-Färbung war in Kombination mit dem histologischen Subtyp mit einem signifikant besseren Überleben assoziiert als eine mittelmäßig starke Färbung der Tumorproben (p = 0,001). Für einen zweiten, auf dem Boden unserer statistischen Analysen errechneten Score ergaben sich bei gleicher Fragestellung nahezu deckungsgleiche Ergebnisse (p = 0,001). Die Gruppierungen der Typ-2-Tumorpatienten zeichneten sich im Vergleich zu den Typ-1-Tumorpatienten, vor allem zu denen mit einer schwachen oder starken c-Myc-Färbung, ebenfalls durch ein größeres Sterberisiko sowie eine tendenziell schlechtere Prognose aus. Die Unterteilung der Typ-2-Tumorpatienten anhand der c-Myc-Färbeintensität konnte keine vergleichbar deutliche Risikostratifizierung der Patienten wie im Falle der Gruppe der Typ-1-Tumorpatienten vorweisen. Zwischen der MINA53-Expression, den klinisch-pathologischen Parametern und dem Patientenüberleben zeigten sich für beide Subtypen (p = 0,375 für Typ 1, p = 0,766 für Typ 2) keine signifikanten Korrelationen. Die angenommene Korrelation zwischen der c-Myc-Expression und dem davon abhängigen Proliferationsmarker MINA53 ließ sich mit unseren Resultaten nicht bestätigen. In unserer Studie zeigte sich in den immunhistochemischen Untersuchungen kein signifikanter Unterschied der MIB-1-Färbung zwischen dem Subtyp 1 und 2 sowie den Mischtypen (p = 0,311). In den Überlebensanalysen starben die Patienten beider Subtypen mit einem höheren Ki-67-Level im Vergleich früher, das Signifikanzniveau von p < 0,05 wurde jedoch jeweils nicht erreicht (p = 0,154 für Typ 1, p = 0,21 für Typ 2). Praktische Schlussfolgerungen In Verbindung mit der histomorphologischen Subtypisierung der Tumore erlaubt eine immunhistochemische Färbung für c-Myc eine bessere Risikoabschätzung und bietet somit prognostisches Zusatzwissen. Insbesondere Patienten mit einem papillären Nierenzellkarzinom des Subtyps 1 profitieren von der prognostischen Aussagekraft des Markers c-Myc, der bei schwachem oder starkem Färbemuster verlässlich eine Gruppierung mit exzellenter Prognose identifizieren kann. Das Follow-Up von 156 Monaten überlebten je nach Scoring-System hier 95,9 % bis 97,6 % der Patienten. Die histologische Erhebung der c-Myc-Färbeintensität erfolgte anhand eines praktikablen und schnellen Bewertungsprinzips, so dass eine Handhabung der c-Myc-Färbung im Rahmen der uropathologischen Auswertung der papillären Nierenzellkarzinome als hilfreich und umsetzbar erscheint. In dieser Arbeit fiel der Marker c-Myc sowohl in seiner Funktion als Onkogen als auch als Tumorsuppressor-Gen auf. Den Pathomechanismus der Aktivierung c-Mycs als Onkogen sowie seiner Stabilisierung als Tumorsuppressor gilt es im Rahmen weiterer Studien zu untersuchen um langfristig neue therapeutische Optionen zu entwickeln.Objectives Renal cell carcinoma is one of the most common cancers worldwide with an estimated incidence of 338,000 new cases per year. Its second most common histopathological subtype, the papillary renal cell carcinoma, includes on the one hand slow-growing neoplasms with multifocal appearance (subtype 1), but on the other hand more aggressive, rapidly progressing tumors (subtype 2) with a worse prognosis. Since the prognostically very relevant subdivision into these subtypes is only clinicallypathologically established from a morphological point of view so far, a more reliable method of differentiation is desirable. At the micro-RNA level as well as molecular genetically, differences have already been found which, among others, affect the c- Myc signaling pathway. In its function as a transcription factor, c-Myc regulates the expression of 15 % of all genes according to current studies and plays an important role in carcinogenesis in many tumor diseases due to its proliferation-promoting and therefore oncogenic effect. The extent to which dysregulation of c-Myc is relevant for the development of the subtypes of papillary renal cell carcinoma and whether the c-Myc expression level differs between the subtypes have not been sufficiently investigated. In this work, therefore, c-Myc and its dependent, proliferation-promoting protein MINA-53 were immunohistochemically investigated for their expression in tumor tissue. Staining with an antibody against the established proliferation marker Ki-67 was carried out in advance. The aim of the present study was to show to which extent the immunohistochemical markers c-Myc, MINA53 and Ki-67 can provide additional benefits in predicting the long-term survival of patients. Design and Methods Within the German multicenter PANZAR consortium, clinical and histopathological data on patients with papillary renal cell carcinoma diagnosed between 1990 and 2007 were collected. The pathological evaluation of the tissue samples was carried out uniformly with determination of the respective tumor subtypes. In this work 339 tumor sections with corresponding clinical data were analyzed. For this purpose, tissue microarrays were evaluated immunohistochemically under the microscope after being stained with antibodies against the proteins c-Myc and MINA53. For the c-Myc and the MINA53 stainings, the valuation was based on the proportion of stained tumor cells and on their staining intensity. This was followed by a statistical analysis of the data using SPSS. Here, the result of a Ki-67 staining, which was used for comparison with the biomarkers, was also included in the statistical analyses. Observations and Results Clinical and survival data showed significantly worse tumor-specific survival of type 2 patients compared to type 1 patients (mean 97.3 months vs. 163.5 months, p = 0.001) and significant less favorable results for clinical parameters as grading (p < 0.001), TNM staging (p < 0.001), invasiveness (p < 0.001) and lymph node and distant metastasis rate (p < 0.001) for subtype 2. Our immunohistochemical evaluation yielded a significantly higher c-Myc-staining intensity of the tumor samples compared to the normal tissue (p = 0.001), a distinction of the two subtypes due to the c-Myc staining behavior was not possible at a significant level (p = 0.221). In our survival analyses, the percentage of c-Myc stained cells, regardless of their staining intensity, was associated with a significantly worse prognosis when combined with the histological subtypes (p < 0.001). Further subdivision of the subtypes by weak, medium or strong c-Myc staining intensity, as assessed by a feasible scoring system, also provided significant results: Lack of or a strong c-Myc staining was, in combination with the histological subtype, associated with significantly better survival than a medium staining of tumor samples (p = 0.001). A second score, calculated on the basis of our statistical analyses, obtained almost identical results (p = 0.001). The group of type 2 tumor patients was characterized by a greater risk of dying compared to the type 1 tumor patients, especially those with a weak or strong c-Myc staining. The subdivision of the type 2 tumor patients on the basis of the c-Myc staining intensity could not show a comparable significant risk stratification of the patients as in the case of the group of type 1 tumor patients. No significant correlation was found between MINA53 expression, clinicopathological parameters and patient survival for both subtypes (p = 0.375 for type 1, p = 0.766 for type 2) of the papillary renal cell carcinoma. The assumed correlation between c-Myc expression and its dependent proliferation marker MINA53 could not be confirmed with our results. In this study, no significant difference in MIB-1 staining between subtypes 1 and 2 and the mixed types (p = 0.311) was found in the immunohistochemical investigations. In the survival analyses, patients of both subtypes with a higher Ki-67 level died earlier. However, the significance level of p < 0.05 was not reached (p = 0.154 for type 1, p = 0.21 for type 2). Conclusions In combination with the histomorphological subtyping of the tumors, the immunohistochemical staining with c-Myc allows a better risk assessment and thus provides additional prognostic knowledge. In particular, patients with papillary renal cell carcinoma of subtype 1 benefit from the prognostic value of the marker c-Myc, which can reliably identify a group with excellent prognosis in case of a weak or strong staining pattern. 95.9 % to 97.6 % of these patients survived the follow-up time of 156 months depending on the scoring system. The histological survey of the c-Myc staining intensity was based on a feasible and rapid evaluation principle, so that the c-Myc staining appears to be helpful and viable in the context of the uropathological evaluation of papillary renal cell carcinomas. In our work, the marker c-Myc strikes attention as an oncogene and as a tumor suppressor gene. The pathomechanism of activation of c-Myc as an oncogene and its stabilization as a tumor suppressor is to be investigated in further studies in order to develop new therapeutic options in the long term