Caracterización de mecanismos de estrés asociados con apoptosis y señales inmunogénicas en células de melanoma murino tratadas con un extracto de plantas rico en polifenoles

El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial, los tratamientos para controlar esta enfermedad se basan en la inducción de la muerte de la célula tumoral. En condiciones fisiológicas esa inducción de muerte celular es inmunológicamente silenciosa (tolerogénica). Sin embargo, durante el tratamiento con algunas terapias antitumorales (como antraciclinas, radioterapia y terapia fotodinámica) se puede generar una muerte celular que estimula la respuesta inmune antitumoral. Esta muerte celular denominada muerte celular inmunogénica (MCI) se caracteriza por el incremento de señales de peligro, entre las que se encuentran la exposición de calreticulina en la membrana celular (Ecto-CRT) y la liberación de ATP y de la proteína HMGB-1 (high mobility group box 1). Se ha descrito que la mayoría de los inductores de MCI, directa o indirectamente inducen estrés oxidativo con la generación de estrés de retículo endoplásmico (RE) y autofagia, para la liberación de señales inmunogénicas. Estos mecanismos de estrés indistintamente pueden contribuir con la sobrevivencia o la inducción de la muerte celular durante el tratamiento, o incluso algunos de ellos favorecen en el microambiente tumoral la generación de células con capacidad inmunosupresora. Debido a la alta resistencia presentada en cáncer como consecuencia del uso de medicamentos que presentan un solo blanco molecular, se han empezado a utilizar combinaciones farmacológicas para tratar de mejorar la muerte celular, en la MCI por ejemplo, se propone combinar fármacos que activen la respuesta al estrés en diferentes organelos para lograr la inducción de todas las señales de peligro. Por otra parte, en la búsqueda de nuevas y eficientes terapias antitumorales que puedan modular positivamente la respuesta inmune, se han venido desarrollando una serie de medicamentos derivados de plantas, los cuales son ricos en polifenoles (compuestos antioxidantes con diferentes actividades antitumorales, antiinflamatorias y antimetastásicas), entre otros . En este sentido, en el grupo de Inmunobiología y Biología Celular de la Pontificia Universidad Javeriana se obtuvo un extracto rico en polifenoles derivado de la planta Caesalpinia spinosa, denominado P2Et. El P2Et ha demostrado tener actividad antitumoral in vitro sobre líneas de cáncer de seno y melanoma, a través de la inducción de apoptosis, autofagia y de señales involucradas con MCI. Estos resultados fueron confirmados en modelos in vivo de cáncer de seno y melanoma en los que se mostró que el tratamiento con P2Et disminuye el tumor de una forma dependiente de la respuesta inmune con la generación de linfocitos T más eficientes y una disminución en células mieloides supresoras. Para determinar cuáles mecanismos utilizan los extractos de plantas ricos en polifenoles como el P2Et y los polifenoles que se asocian a ese tipo de extractos, para favorecer la inducción de MCI, en este trabajo se hizo un análisis mecanístico en donde se evaluó el papel del estrés de retículo y la autofagia en la inducción de muerte celular y en la generación de señales inmunogénicas. Para ello se utilizaron células B16-F10 de melanoma murino, las cuales fueron tratadas con P2Et o con los dos polifenoles más abundantes en el extracto ácido gálico (AG) y etil galato (EG, y se combinaron con inhibidores químicos de estrés de RE y de autofagia. Por otra parte, se generaron clones de células B16-F10 carentes de genes necesarios para la activación de estrés de RE y de autofagia utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y se trataron con el extracto y los polifenoles. Cuando se evaluó la inducción de estrés de RE, se observó un incremento significativo en las vías de señalización de PERK e IRE-1alpha con P2Et llamando la atención que no hubo incremento de las especies reactivas de oxígeno. Por otra parte, no se observó incremento en la inducción de estrés de RE con AG y solo un ligero incremento con EG que no fue significativo. La muerte celular mediada por P2Et fue totalmente dependiente de la activación de PERK, que llevo al incremento en los niveles de calcio citoplasmático y a su vez, estos se asociaron con pérdida del potencial de la membrana mitocondrial y la inducción de muerte por apoptosis. Por otra parte, la inhibición de la autofagia aumento la muerte mediada por P2Et y EG, mientras que disminuyó la muerte en células tratadas con AG, sugiriendo que este último induce una autofagia citotóxica. Adicionalmente, se encontró que de los dos polifenoles solo el EG induce señales de MCI pero en menor proporción comparado con P2Et. Interesantemente, se identificó que la vía PERK es necesaria también para la expresión de los tres marcadores de muerte inmunogénica estudiados en células tratadas con P2Et y que la autofagia contribuye con la liberación de CRT y ATP. Estos resultados demuestran que el mecanismo por el cual P2Et induce MCI es diferente a los mecanismos previamente descritos para otros inductores de MCI, además que el uso del extracto complejo es ventajoso frente al uso de los polifenoles aislados, lo cual confirma el potencial que tienen los extractos complejos en el tratamiento del cáncer.COLCIENCIAS a través del proyecto 120356934797Vicerrectoría de Investigaciones de la Pontificia Universidad Javeriana, Sede Bogotá-Proyecto 007682Sistema General de Regalías (BPIN: 2013000100196, número de contrato 1027-1-2015)Cancer is the second leading cause of death globally; treatments to control of cancer are based on tumor cell death. Under physiological conditions, cell death is silent without immune activation (tolerogenic). However, during the treatment with some antitumor therapies (such as anthracyclines, radiotherapy, and photodynamic therapy) the cell death can induce an antitumor immune response. This form of cell death is called immunogenic cell death (ICD) and it is characterized by an increase in the danger-associated molecular pattern (DAMPS) like the exposure of calreticulin in the cell membrane (Ecto-CRT) and release of ATP and HMGB-1 (high mobility group box 1 protein). Appropriate cellular stress responses are necessary for the production of danger signals during ICD including the activation of mediators related to oxidative stress, endoplasmic reticulum (ER) stress and autophagy. The stress response also has several functions: it can increase tumor cells survival or it has immunosuppressive functions over immune tumor infiltrate, otherwise, the stress response is involved in cell death. Therapies derived from natural compounds have demonstrated antitumor potential along with a low risk of side effects also have more tolerable toxicity profiles than conventional chemotherapeutic drugs. Plant extracts contain a diverse range of compounds including polyphenols, which may exert their therapeutic functions by increasing ER stress, inducing oxidative stress or promoting apoptosis of tumor cells. For these reasons, natural compounds have been considered a resource for developing new chemotherapeutic drugs or chemosensitizing agents. In this sense, our group has been working with P2Et, a polyphenol-rich extract obtained from plant Caesalpinia spinosa that promotes antitumor activities through the induction of immunogenic cancer cell death (ICD). Vaccination with P2Et-treated cells induced an immune-mediated reduction in tumor volume; while immunocompetent mice exhibited decreased tumor growth, the tumor-protective effect was abolished in immunodeficient mice. Here, we sought to elucidate the mechanism used by P2Et and associated polyphenols in apoptosis and ICD induction in murine melanoma cells. In this work, a mechanistic analysis was carried out to determine the role of ER stress and autophagy on cell death and ICD induction. We treated B16-F10 melanoma cells with P2Et, Gallic acid (GA) or Ethyl gallate (EG) (most abundant polyphenols in P2Et extract). On the other hand, we used the CRISPR/Cas9 system to generate knock out in genes involved with ER stress and autophagy. After, B16-F10 treatment we observed that P2Et increases ER stress mediated through PERK and IRE-1 activation. Besides, GA is not an inducer of ER stress and EG only has a slight increase. Interestingly, P2Et-mediated cell death was PERK-dependent, followed by an increase in calcium levels, without alteration in reactive oxygen species. Therefore, P2Et treatment induces mitochondrial membrane potential loss to generate apoptosis. Otherwise, autophagy inhibition increases cell death mediated by P2Et and EG, while apoptosis decreased in cells treated with GA, suggesting that GA induces a cytotoxic autophagy. In addition, it was found that only EG induced MCI signals but in less proportion compared with P2Et. Remarkably, we showed that PERK pathway is necessary for the expression of the immunogenic cell death markers in P2Et treated cells. In the same way, autophagy contributes to Ecto-CRT and ATP release. These results showed that P2Et induces MCI through a different mechanism comparing with other MCI inducers. Furthermore, we observed that complex extracts use could be advantageous compared to the use of isolated compounds, these results confirm the potential of complex extracts in the treatment of cancer.Doctor en Ciencias BiológicasDoctorad