Retinoic acid: a key regulator of vertebrate embryonic development

Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015O ácido retinóico é uma molécula sinalizadora, sintetizada a partir da vitamina A, necessária para o correto desenvolvimento embrionário dos vertebrados, uma vez que regula a transcrição de genes essenciais durante vários processos da embriogénese. A relação entre a sua produção e degradação, respetivamente através das enzimas Raldh2 e Cyp26a1, leva a que a sua atividade sinalizadora ocorra de uma forma bastante específica quer em termos de dose, localização da sua atuação (tecido) ou quer em termos temporais. De facto, a alteração dos níveis de ácido retinóico durante o desenvolvimento embrionário pode ser letal ou dar origem a doenças congénitas (como por exemplo, spina bífida). Uma das etapas mais importantes na embriogénese dos vertebrados é a gastrulação. Durante esta, para que a formação dos três folhetos germinativos (que mais tarde irão dar origem a todos os tecidos e órgãos do organismo) possa ocorrer devidamente, é necessário um correto controlo da atividade sinalizadora mediada pelo ácido retinóico, que nesta fase do desenvolvimento é fundamentalmente fornecido por via materna (caso dos ratinhos), dado que alterações na sua degradação enzimática pelas Cyp26 podem resultar na morte do embrião. Tal ocorre uma vez que o ácido retinóico controla a expressão de Nodal (excesso de ácido retinóico provoca a indução ectópica de Nodal), proteína indispensável para que se dê o início da gastrulação através da formação da linha primitiva, decorrente da migração das células do epiblasto para a parte mais posterior do embrião7. Aparentemente a introdução de um transgene (T-streakCreERT) juntamente com o alelo repórter ROSA26R-β-gal em ratinhos mutantes para o gene Gdf11, produziu letalidade embrionária durante a gastrulação8. Após verificarmos que o efeito não era devido ao transgene por si próprio, mas sim possivelmente ao local onde este foi inserido no genoma de uma linha particular (#47), procurámos caracterizar molecularmente os embriões Gdf11-/-::T-streak-CreERT#47+/0 de forma a tentar encontrar a causa desta aparente letalidade. A alteração dos níveis de ácido retinóico observada nos embriões Gdf11-/- durante a transição entre a formação de tecidos do tronco e da cauda, fez-nos considerar a possibilidade de durante a gastrulação ocorrer uma alteração semelhante desses níveis, que combinada com possíveis efeitos do transgene pudesse resultar na morte dos referidos embriões. No entanto, as experiências realizadas não só não permitiram a identificação de qualquer problema durante a gastrulação, decorrente da mutação no gene Gdf11 e/ou do transgene T-streak-CreERT#47+/0, como demonstraram a correta formação da linha primitiva nos embriões Gdf11-/-::T-streak-CreERT#47+/0. Estudos adicionais mostraram ainda viabilidade dos embriões Gdf11-/-::T-streak-CreERT#47+/0 a E10.5. Uma possível explicação para este facto prende-se com a estratégia utilizada na genotipagem do alelo mutante de Gdf11, pois usava iniciadores desenhados para amplificar parte da cassete de neomicina (introduzida para criar a mutação nesse gene9) que também está presente no alelo repórter ROSA26-β-gal, que formava parte das experiências originais que levaram à nossa hipótese inicial. Assim sendo, é bastante provável que os erros cometidos na determinação do genótipo dos progenitores dos embriões Gdf11::ROSA26R-β-gal+/0::T-streakCreERT#47+/0, tenham levado a utilizar ratinhos Gdf11+/+ e não Gdf11+/- nos cruzamentos, criando a ilusão de uma ausência de embriões Gdf11-/- nestas ninhadas. De qualquer forma, relativamente à hipótese da alteração dos níveis de ácido retinóico nos mutantes Gdf11, foi possível concluir que aparentemente essa alteração não se verifica durante a gastrulação, uma vez que a expressão tanto de Cyp26a1, como de Nodal permaneceram sem alterações. Após a gastrulação, nos vertebrados, dá-se primeiro a formação da cabeça (na parte mais anterior do embrião) e depois por um processo de extensão axial, no sentido anterior para posterior, é formado o pescoço, a seguir o tronco e por último a cauda. Apesar do desenvolvimento destas estruturas ser progressivo e de depender dos progenitores axiais, parece que a forma como estas diferentes partes do corpo são criadas é diferente. Mutações nos genes T, Cdx e Wnt3a suportam esta teoria, segundo a qual a posição dos membros superiores e inferiores delimita os referidos blocos estruturais do embrião (cabeça/pescoço, tronco e cauda). Como referido anteriormente, o mecanismo segundo o qual ocorre a transição tronco-cauda já foi demonstrado pelo nosso laboratório, mas a transição entre a formação da cabeça e do tronco ainda permanece por esclarecer. Curiosamente a mutação da enzima Raldh2, que leva à inexistência de ácido retinóico nos tecidos neurais e na mesoderme, leva à morte do embrião após o desenvolvimento ser interrompido ao nível dos membros anteriores. Mas, se for administrado ácido retinóico até essa altura do desenvolvimento (~E8.25) o embrião é capaz de ultrapassar esse bloqueio e formar as seguintes estruturas (tronco e cauda). Esse facto fez-nos considerar a hipótese de que o ácido retinóico pode estar a controlar o mecanismo de transição entre a formação da cabeça e do tronco. Para identificar essa necessária mudança nos progenitores axiais, dependente do ácido retinóico, efetuámos uma análise transcriptómica comparativa a partir de ARN isolado das caudas de embriões “tipo selvagem” a E8.75/E9.0 (ou seja, onde a transição já foi efetuada e estão a ser criados os tecidos do tronco) e de embriões Raldh2-/- da mesma idade (nos quais esta transição encontra-se bloqueada). Após análise dos resultados presentes na RNA-seq, foi selecionado um grupo de genes candidatos com base na grandeza da expressão diferencial observada entre embriões tipo selvagem e Raldh2-/-, e tendo em conta a sua significância e função biológica. Vários genes desse grupo (exemplo: Wnt3a, Dkk1 e Cav1) estão associados à sinalização Wnt, cuja atividade canónica (via -catenina) parece estar diminuída na cauda dos embriões mutantes. Esta observação é bastante interessante, tendo em conta a comparação dos fenótipos dos embriões mutantes para Wnt3 (que apresentam ausência total de mesoderme), com o fenótipo dos embriões Wnt3a-/- (em que o desenvolvimento apenas ocorre de forma normal até ao nível do membro anterior), sugerindo que a atividade do ácido retinóico possa ser responsável por esta mudança na sinalização Wnt (de depender de Wnt3 e passar a depender de Wnt3a). Sendo que esta hipótese contrasta com a observação de que a expressão de Wnt3a parece estar aumentada na cauda dos mutantes, é possível que a existência de regulação diferencial dos vários componentes da sinalização Wnt nos embriões Raldh2-/- possa resultar na incapacidade dos progenitores de responder apropriadamente a Wnt3a, ocorrendo dessa forma a inibição da sinalização canónica de Wnt. Por esse motivo, através de hibridação in situ procurámos observar a expressão de alguns desses genes envolvidos na sinalização Wnt e complementámos esses estudos com uma abordagem de sobre-expressão através da utilização de transgénicos (onde o gene avaliado foi associado ao promotor de Cdx2 que expressa nos progenitores do eixo). Estudos similares foram também feitos com outros genes não associados à sinalização Wnt (Mesp1 e Fgf4). No entanto as nossas experiências não permitiram determinar o mecanismo inerente à mudança nos progenitores, necessária para que o embrião termine de criar tecidos da cabeça e inicie a produção de tecidos do tronco. Ainda sobre a forma como a atividade do ácido retinóico influência os progenitores axiais, através de hibridação in situ, confirmámos que na mesoderme pré-somítica, a área onde tanto T como Sox2 são expressos é menor nos embriões Raldh2-/-. Em experiências preliminares foi possível observar, através de imunofluorescência, a existência de células que expressam T e Sox2 (apesar de não ter sido possível contabilizá-las), indicando dessa forma a presença dos progenitores axiais nos embriões Raldh2-/-. Por último, surpreendentemente ao que está publicado, verificámos que em alguns embriões Raldh2-/- é possível observar umas pequenas protuberâncias onde Tbx5 (marcador da indução dos membros anteriores) encontra-se expresso mais tarde no desenvolvimento (do que aquilo que seria suposto) e em menor quantidade. Por isso, considerando o fenótipo decorrente da mutação de Cyp26a1 (onde ocorre uma transformação homeótica da vertebra cervical C5 para C6 e da C7 para uma vertebra torácica), é possível que o ácido retinóico seja crucial durante este período do desenvolvimento, definindo o tempo em que ocorre a transição entre a formação da cabeça (pescoço) e do tronco no embrião. Apesar desta hipótese necessitar de uma validação experimental, conectando a transição cabeça-tronco e a indução dos membros anteriores, todas as evidências apontam no sentido de que a atividade do ácido retinóico nos progenitores axiais é apenas necessária durante a transição cabeça-tronco (e não durante todo o processo de extensão axial) sendo depois restringida, pela Cyp26a1, a zonas mais anteriores do embrião.Retinoic acid (RA) is a signalling molecule, derived from vitamin A, necessary for proper vertebrate embryonic development. It acts in a tissue, time and dose specific manner, shaping the embryo through the regulation of several master transcription factors. Alterations in RA levels during embryonic development are known to cause several problems, including embryonic lethality. During gastrulation, the formation of the three germ layers requires balanced interaction between RA and Cyp26 molecules, which is crucial for Nodal expression7. Interestingly, in Mallo’s lab, embryos carrying a transgene (T-streakCreERT), the cre reporter allele ROSA26R-β-gal, and a total inactivation of Gdf11, seemed to die during this stage8. Considering the interaction between Gdf11 and Cyp26a1, we hypothesized that the transgene, together with Gdf11 might have affected RA signalling. However our experiments failed to find any indication of patterning problems that could justify the early lethality that was initially observed. Additional analyses indicate that the original phenotype might have resulted from incorrect genotyping of the parent lines. Also, we could conclude that despite what happens during the trunk to tail transition in Gdf11-/-, in these mutants RA signalling seems not to be affected during gastrulation. Embryos lacking RA (Raldh2-/-) become truncated at the forelimb level. Since Raldh2 mutant embryos exposed to acute RA treatments at E8.25 acquire trunk and tail structures we concluded that RA signalling controls the mechanism regulating the head to trunk transition. To understand this process we performed a comparative transcriptomic analysis between tails of Raldh2-/- and wild type embryos. So far, we could not elucidate the mechanism for this transition but our evidence suggests that it possibly involves Wnt signalling. Also our experiments, concomitantly with data regarding Cyp26a1, seem to indicate that RA activity in the axial progenitors is only necessary during this transition, thus setting the time at which it occurs