Evolução da resistência aos antibióticos em estirpes isoladas de diferentes reservatórios

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015A resistência aos antibióticos é um problema global e atual. O uso e mau uso de antibióticos não só em medicina humana e veterinária, mas também no ambiente, são fatores responsáveis pela emergência e disseminação de bactérias multirresistentes. A difusão das β-lactamases de espectro alargado (ESBL) constitui o principal mecanismo de resistência às cefalosporinas de 3ª geração em bactérias de Gram-negativo. Atualmente, as ESBL, particularmente as produtoras de CTX-M, têm emergido em diferentes reservatórios (animal, homem e ambiente). A produção de CTX-M, concomitantemente com a resistência a outras classes de antibióticos, ou mesmo por coprodução de outras β-lactamases (como as carbapenemases), tem constituído uma forma das bactérias se tornarem multirresistentes. No sentido de avaliar a evolução da resistência aos antibióticos em estirpes de Escherichia coli isoladas de diferentes reservatórios, este trabalho teve como objetivos específicos: a) investigar a diversidade das β-lactamases produzidas por 68 isolados de origem humana e animal e avaliar a sua suscetibilidade às diferentes classes de antibióticos; b) caracterizar a estrutura-função da nova enzima CTX-M-166 e estudar as suas consequências fenotípicas. Para alcançar estes objetivos, foi utilizada uma combinação de métodos fenotípicos, de biologia molecular e bioquímicos. A caracterização molecular dos mecanismos de resistência permitiu identificar uma grande diversidade de β-lactamases: penicilinases (TEM-1 e OXA-tipo); ESBLs da família CTX-M [CTX-M-1, CTX-M-14, CTX-M-15 (mais prevalente), CTX-M-27, CTX-M-32 e CTX-M-166 (nova variante)], TEM (TEM-52) e SHV (SHV-12); resistentes aos inibidores (TEM-30/IRT-2); e AmpCs plasmídicas (CMY-2 e DHA-1). Foram também identificados genes plasmídicos de resistência às fluoroquinolonas: aac(6’)-Ib-cr e qnrB 19. Dos 68 isolados analisados, 75% revelaram ser multirresistentes. A determinação das constantes cinéticas da CTX-M-166, identificada num isolado de origem animal, permitiu verificar uma diminuição na eficiência catalítica (kcat/Km), em comparação com a CTX-M-1. Contudo, a substituição aminoacídica Ala120Val contribuiu para o aumento da afinidade (Km) para a penicilina G, piperacilina, cefotaxima e ceftiofur, sendo este último antibiótico exclusivamente utilizado em medicina veterinária. Em conclusão, este estudo evidenciou uma grande diversidade de β-lactamases em isolados de E. coli de vários reservatórios, e uma elevada prevalência de multirresistência. Contribuiu ainda para uma melhor compreensão da evolução das propriedades catalíticas das enzimas CTX-M.Antibiotic resistance is a global and current problem. The use and misuse of antibiotics, not only in human and veterinary medicine, but also in the environment, are factors responsible for the emergence and spread of multidrug resistant bacteria. The spread of extended spectrum β-lactamases (ESBL) constitute the main mechanism of resistance to 3rd generation cephalosporins in Gram-negative bacteria. Currently, ESBL-producing bacteria, particularly CTX-M, have emerged in different reservoirs (animal, human and environment). The production of CTX-M, concomitantly with resistance to other classes of antibiotics, or even co-production of other β-lactamases (such as carbapenemases) has greatly contributed to the emergence of multidrug resistant bacteria. In order to assess the evolution of antibiotic resistance in isolates of Escherichia coli from different reservoirs, this study included the following objectives: a) to investigate the diversity of β-lactamases produced by 68 isolates of human and animal origin, and to evaluate their susceptibility to different classes of antibiotics; b) to characterize the structure and function of the new CTX-M-166 enzyme and to study its phenotypic consequences. Globally, in order to achieve these goals, a strategic combination of phenotypic, molecular and biochemical methods were applied. The molecular characterization of resistance mechanisms allowed the identification of a large diversity of β-lactamases: penicillinases (TEM-1 and OXA-type); ESBLs from CTX-M family [CTX-M-1 CTX-M-14, CTX-M-15 (the most prevalent), CTX-M-27, CTX-M-32 and CTX-M-166 (new variant)]; TEM (TEM-52) and SHV (SHV-12); resistance to β-lactamase inhibitors (TEM-30 / IRT-2); and plasmidic AmpCs (CMY-2 and DHA-1). The investigation of plasmid-mediated quinolone resistance identified aac(6’)-Ib-cr and qnrB 19 genes. Among the 68 isolates analyzed, 75% were found to be multidrug resistant. The determination of the kinetic constants of the new CTX-M-166, identified in an isolate of animal origin, showed a reduction in the catalytic efficiency (kcat/Km), when compared to CTX-M-1. However, the aminoacid substitution Ala120Val contributed to an increase in the affinity (Km) for penicillin G, piperacillin, cefotaxime and ceftiofur; it is worth mentioning that this last antibiotic is exclusively used in veterinary medicine. In conclusion, this study demonstrated the existence of a great diversity of β-lactamases in E. coli isolates recovered from different reservoirs, and a high prevalence of multidrug resistance. The results also contributed to a better understanding of the evolution of the catalytic properties of the CTX-M enzymes