Proteómica da Apneia Obstrutiva do Sono para a descoberta de biomarcadores

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015A síndrome da apneia obstrutiva do sono (SAOS) é um importante problema de saúde pública, não só por comprometer o estilo de vida e bem-estar do doente, mas também por ser um factor de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, metabólicas e carcinogénicas. Apesar de grandes avanços nos métodos de diagnóstico e tratamento da SAOS, permanecem ainda por esclarecer os mecanismos moleculares que levam ao seu desenvolvimento e às patologias associadas. A avaliação do perfil proteómico do plasma sanguíneo que possa estar associado à SAOS, aos vários estadios da doença ou à resposta/eficácia do tratamento com pressão positiva contínua das vias aéreas (CPAP), foi o objectivo último deste estudo. As proteínas constituintes deste perfil, uma vez validadas, são potenciais biomarcadores de diagnóstico, prognóstico e/ou de monitorização terapêutica da SAOS. Numa primeira fase foi necessária a optimização da preparação de amostras de plasma e sua análise por electroforese bidimensional (2DE) em mini-géis, para futura identificação de proteínas diferencialmente expressas na doença/condição, por espectrometria de massa. Este objectivo do projecto foi concluído com sucesso, pois mostrou que a utilização de 2DE em minigeis é possível em análises futuras com uma boa relação custo-eficácia. Em paralelo, investigou-se se o estado redox-oligomérico da proteína peroxiredoxina 2 (Prx2) (um biomarcador de inflamação/stress oxidativo), encontrava-se alterado no plasma de doentes com SAOS e, se esta alteração, era parcialmente revertida após tratamento CPAP, tal como vem sendo observado nos eritrócitos destes doentes (dados preliminares do laboratório). A validação em plasma dos dados de proteómica obtidos em eritrócitos, poderá contribuir para uma melhor compreensão da relevância do papel da Prx2 na SAOS. Para isso, selecionaram-se amostras de plasma ‘noite’, recolhidas na noite anterior ao diagnóstico polissonográfico e ‘manhã’, recolhidas na manhã seguinte para cada indivíduo roncador (controlo) e doente SAOS (ligeira, moderada e grave). Para estes últimos, foram também recolhidas amostras matinais ‘CPAP’, após seis meses de tratamento. As amostras de plasma foram analisadas por 1DE SDS-PAGE reduzido e não-reduzido (com ou sem agente redutor), seguido de western blotting com anticorpo específico para a Prx2 ou PrxSO2/3 (formas hiperoxidadas da Prx2). Os resultados indicaram que as formas hiperoxidadas estavam aumentadas nos doentes SAOS, mais significamente (p≤0,05) à noite, em relação aos indivíduos controlo. O tratamento CPAP pareceu reduzir esta hiperoxidação. Estes resultados corroboram os resultados obtidos nos eritrócitos destes doentes. No entanto, formas da Prx2, possivelmente com outras modificações pós-traducionais, que não a hiperoxidação, também mostraram uma tendência para um aumento matinal nos doentes SAOS. Esta tendência foi significativamente (p≤0.05) reduzida após tratamento. Estes resultados, embora preliminares, são interessantes dado que a presença desta proteína no meio extra celular ser reconhecida como uma sinalizadora de stress/inflamação. Em suma, os dados obtidos são motivadores para se prosseguir com a investigação no plasma, no desenvolvimento futuro de novas ferramentas de diagnóstico, prognóstico e/ou monitorização terapêutica da SAOS.The obstructive sleep apnea (OSA) is a major public health problem, not only for compromising the lifestyle and the patient's well-being but also to be itself a risk factor for developing cardiovascular, metabolic and carcinogenic diseases. Despite great advances in diagnostic methods and treatment of OSA, still remain to be elucidated the molecular mechanisms that lead to its development and associted pathologies. The assessment of blood plasma proteomic profile that may be specifically associated with OSA, OSA severety or the response/efficacy of continuous positive airway pressure (CPAP) treatment, was the ultimate goal of this study. The proteins that constitute this profile, once validated, are potential biomarkers of diagnostic, prognostic and/or therapeutic monitoring of OSA. In a first phase, it was necessary to optimize the preparation of human plasma sample and its analysis by two-dimensional electrophoresis (2DE) on mini-gels, for future identification of differentially expressed proteins in the disease/condition by mass spectrometry. This objective was successfully completed, by showing that the use of 2DE minigels is possivel in future cost-effective analysis. In parallel, it was investigated wheather the redox-oligomeric state of the protein peroxiredoxin 2 (Prx2) (a biomarker of inflammation/oxidative stress) was changed in plasma of OSA patients and wheather this change was parcially reverted by CPAP treatment as it has been observed in erythrocytes of this patients. The validation of erythrocyte data in plasma, may contribute to a better understanding of the importance of the role of Prx2 in OSA. For this, “night” and “morning” plasma samples were selected, taken in the night before polysomnographic diagnosis, and in the next morning, respectively, from snorers (control) and OSA patients (mild, moderate or severe). For these last ones, morning samples "CPAP" were also collected, after six months of treatment. The samples were analyzed by reduced and non-reduced 1DE SDS-PAGE (with or without reducing agent), followed by western blotting with specific antibodys for Prx2 or PrxSO2/3 (hiperoxidized forms of Prx2). The results indicated that the hiperoxidized forms were increased in OSA patients plasma, most significantly (p≤0.05) at night compared to the control ones. The treatment seemed to reduce this hyperoxidation. These results corroborate with the study conducted in erythrocytes. However, forms of Prx2, probably with other post-translational modifications, which do not hyperoxidation, also showed a trend towards an morning increase in OSA patients. This tendency was significantly (p≤0.05) reduced after treatment. These results, although preliminary, are interesting due to the presence of this protein in the extracellular medium and be recognized as a signal of stress/inflammation. In summary, the data are motivating to proceed with the investigation in plasma, in the future development of new diagnostic, prognostic and/or therapeutic monitoring of OSA