Adipose stromal vascular fraction cell sheets as vascular strategies for tissue engineering and regenerative medicine applications

Tese de mestrado em Engenharia Biomédica e Biofísica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015A Engenharia de Tecidos (TE), uma subárea da Medicina Regenerativa (RM), surge como uma tentativa de reparar doenças ou defeitos usando células, tecidos e biomateriais, isoladamente ou em combinação, para restaurar ou melhorar funções biológicas. A Engenharia de Cell Sheet (CS) é uma técnica de TE baseada em células que usa superfícies de cultura sensíveis a estímulos de temperatura para fabricar monocamadas celulares intactas e robustas que podem ser implantadas sem requerer o apoio de um scaffold, evitando assim algumas das várias restrições às quais eles estão associados. A criação de estruturas de CS viáveis e espessas, necessárias para regenerar tecidos mais robustos como o osso, é limitada pela falta de estratégias de vascularização eficazes, antes da implantação. A falta de vascularização adequada resulta, muitas vezes, em necrose celular e rejeição da estrutura sendo, por isso, uma das maiores preocupações na área da TE. Na comunidade científica, diversas estratégias foram propostas neste sentido, muitas delas envolvendo o uso de células endoteliais que, embora bastante promissoras, enfrentam múltiplos desafios como sendo as fontes de células e a estabilidade dos novos vasos sanguíneos formados. A estratégia aqui descrita resulta de uma optimização dos diferentes aspectos relativos à cultura celular para obter CS capazes de desenvolver, in vitro, uma rede de estruturas semelhantes a capilares sem adição de factores de crescimento extrínsecos. Estas CS são derivadas do isolamento da fracção vascular estromal (SVF) do tecido adiposo após dissociação enzimática por acção da colagenase. Este tecido tem vindo a destacar-se na comunidade científica pelas suas características: é abundante, prescindível e pode ser facilmente obtido. Para além disso, a SVF é considerada como sendo detentora de um potencial angiogénico intrínseco, em virtude do tipo de células que a compõem. As células da SVF isoladas a partir de tecido proveniente de lipoaspirações foram distribuídas por placas estéreis de 24 poços numa densidade de 2x105 células nucleadas/poço e cultivadas em condições de normóxia (21%) e hipóxia (5% de oxigénio) com meio basal durante 8 dias. Foram efectuados diversos testes in vitro após terem sido atingidos os time points de 5 e 8 dias, nomeadamente citometria de fluxo (também efectuada imediatamente após o isolamento), quantificação de ADN, ensaios de matrigel e scratch, ELISA, imunocitoquímica e western blot. Para além disso, foram também efectuados ensaios in vivo após indução de isquemia nos membros posteriores que foram avaliados por imunohistoquímica, hibridização in situ e laser Doppler. A análise dos marcadores de superfície das células da SVF por citometria de fluxo evidenciou que a expressão dos marcadores endotelial CD 31 e hematopoiético CD 34 decresce ao longo do tempo, o que seria expectável uma vez que a cultura foi efectuada em meio basal, sem adição de factores de crescimento extrínsecos. Na literatura, a SVF do tecido adiposo é descrita como sendo composta por diversas populações de células, incluindo células estromais, endoteliais e hematopoiéticas, facto que foi comprovado nesta análise. Os resultados relativos à proliferação celular de células da SVF mostram que não há diferenças significativas entre as condições de normóxia e hipóxia sugerindo que a proliferação destas células não é afetada significativamente pelas concentrações de oxigénio. A imunocitoquímica realizada para os marcadores CD 31 e para o CD 146, o qual marca péricitos, demonstram a organização de células da SVF em estruturas tipo capilares para ambas as condições, embora o nível de ramificação tenha sido mais complexo em hipóxia para 8 dias. A comprovar este facto, a quantificação das estruturas tipo capilares no Angiogenesis Analyzer, um plug-in do programa Image J, destacou que as formações seriam mais maduras e organizadas nessas mesmas condições. Esse facto tornou-se mais evidente num dos dadores devido ao decréscimo no número de segmentos e malhas formados pelas células ao longo do tempo, sendo que o nível de ramificação se manteve praticamente inalterado. Isso traduziu-se em segmentos mais alongados e interconectados entre si. Foi levantada a hipótese de que a secreção de factores de crescimento pelas células em condições de hipóxia poderia estar envolvida neste efeito. Como tal, foram efectuados diversos ensaios utilizando os meios condicionados recolhidos das culturas em diferentes condições. Um ensaio de matrigel utilizando um extracto de membrana basal proteico que favorece a angiogénese, evidenciou um aumento na formação de estruturas tipo capilares pelas células endoteliais cultivadas em meio condicionado hipóxico. Os mesmos meios condicionados aumentaram a migração de células estaminais do tecido adiposo humano (hASCs) num ensaio scratch, quando comparados com os meios recolhidos de normóxia. O ensaio scratch é um ensaio baseado na raspagem da zona central de uma monocamada celular para avaliar a migração das células em torno da área erodida, sob diferentes condições. A produção de factores de crescimento avaliada por meio de ELISA sugeriu uma maior secreção do VEGF para condições de hipóxia. Colocou-se a hipótese que este facto poderia estar relacionado com a estabilização das subunidades dos HIFs (hypoxia inducible factors) em condições de concentrações baixas de oxigénio. OS HIFs são uma família de factores de transcrição constituída por três subunidades principais HIF-1, HIF-2 e HIF-3 e os seus respectivos heterodímeros (alfa e beta). As subunidades alfa respondem a variações na concentração de oxigénio e sob condições de oxigénio atmosféricas (normóxia) são constantemente expressas e degradadas no citoplasma, mais concretamente no proteassoma. Em condições de stress de oxigénio estas subunidades migram para o núcleo onde se ligam aos seus heterodímeros, os quais são constitutivamente expressos, e estabilizam. Esta estabilização resulta num aumento da secreção de diversos factores de crescimento responsáveis pela regulação do metabolismo da glucose, eritropoiese e angiogénese como sendo o VEGF e o PDGF. Deste modo, foi efectuada uma análise por western blot para o HIF-1α a qual destacou bandas mais proeminentes para condições de hipóxia. Paralelamente às condições de hipóxia e normóxia foram também testadas a incubação das células com um inibidor da subunidade HIF-1α e com cloreto de cobalto II, um indutor químico de condições de hipóxia. Como seria expectável, a banda obtida na análise de western blot para o inibidor foi bastante ténue contrariamente à obtida com o mimetizador das condições de hipóxia. Em imunocitoquímica isto reflectiu-se num fraco e proeminente desenvolvimento das estruturas tipo capilares, respectivamente, facto que veio reforçar a hipótese proposta. Finalmente, depois da manutenção das CS por 8 dias em condições de normóxia e hipóxia foi efectuada a sua implantação in vivo em ratinhos durante 33 dias, após indução de isquemia no membro posterior. A imunohistoquímica dos explantes recuperados executada para os marcadores endotelial CD 31 e perivascular α-SMA destacou uma melhoria na neo-angiogénese em condições de hipóxia por comparação com as de normóxia e controlos. Foi efectuado também um ensaio de hibridização in situ para localizar as células humanas nos explantes e verificou-se que algumas destas células permaneciam na área da implantação em torno dos novos vasos sanguíneos formados. Os resultados obtidos através do laser Doppler demonstram que a perfusão dos vasos sanguíneos aumentou nos animais em que foram transplantadas as cell sheets. Para além disso, foi observado que nos animais que receberam as cell sheets provenientes de culturas em hipóxia havia uma tendência para uma recuperação mais rápida do fluxo sanguíneo. Tendo em consideração todos os resultados obtidos é importante salientar o excelente potencial da estratégia aqui descrita que resulta da combinação de diversos conceitos como sendo, condições de hipóxia, células da SVF e Engenharia de Cell Sheet (CS) para criar unidades de vascularização funcionais para TE e RM.Tissue Engineering (TE), a subfield of Regenerative Medicine, arises as an attempt to repair diseases or defects by using cells, tissues and biomaterials isolated or in combination, to restore or improve biological functions. Cell sheet (CS) engineering is a TE cell-based technique that uses stimuli-responsive culture surfaces to fabricate robust and intact cell monolayers that can be implanted without requiring the support of a scaffold. The creation of viable thick CS constructs is limited by the lack of suitable vascularization strategies prior to implantation. The herein described strategy results from the optimization of different aspects of cell culture to obtain cell sheets capable of developing a capillary-like network in vitro without adding extrinsic growth factors. These cell sheets are derived from the isolation of the stromal vascular fraction (SVF) of adipose tissue, which is composed of different cell populations including stromal, endothelial and hematopoietic cells, holding thus an intrinsic angiogenic potential. The culture was performed with basal medium in normoxic (pO2 = 21%) and hypoxic (pO2 = 5%) conditions for up to 8 days. Cell proliferation results showed no significant differences between all conditions. Immunocytochemistry performed with the endothelial marker CD 31 and CD 146 that stains pericytes demonstrated the organization of SVF cells in capillary-like structures for both conditions, although the level of branching was much more complex in hypoxia. It was hypothesized that the secretion of growth factors by cells was involved in this effect. A matrigel assay using conditioned media from the different conditions showed increased formation of capillary-like structures by endothelial cells cultured in hypoxic conditioned media. The same conditioned media increased the migration of human adipose stem cells (hASCs) in a scratch assay, when compared with media collected from normoxia. The production of growth factors assessed through ELISA suggested higher secretion of VEGF for hypoxia although statistical analysis showed no significant differences by comparison with normoxia. Western blot for HIF-1α expression highlighted more prominent bands for hypoxic conditions. In vivo implantation of cell sheets cultured for 8 days in normoxia and hypoxia following a hind limb ischemia model showed improved neo-angiogenesis as evidenced by immunohistochemistry and laser Doppler. These results highlight the outstanding potential of combining hypoxic conditions and SVF cells to create cell sheets that can be used as functional vascularization units for TE and RM