Development of a membrane based detection of Candida albicans

Tese de mestrado integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica , apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015Candida é uma família de fungos, normalmente, presente na flora gastrointestinal, nos orgãos genitais, no sistema respiratório e na pele de pessoas saudáveis e, até determinada quantidade, não trazem nenhum risco. Apenas 17 espécies de Candida podem ser consideradas como patogénicas para o ser humano e, dentro deste grupo, Candida albicans é a espécie mais comum e pode ser facilmente encontrada em ambiente hospitalar, comida, solo e outros animais, sendo, por isso, a probabilidade de adquirir este fungo elevada. Candida albicans é unicelular e com forma ovóide, tendo entre 4 e 6 μm de diâmetro. Esta espécie reproduz-se produzindo blastoconídios (ou gêmulas) e quando o processo de divisão não está completo produz pseudo-hífas ou, dependendo das condições, pode mesmo produzir hífas. O nível de desenvolvimento de hífas promove a patogenicidade deste tipo de fungos. C. albicans cresce aerobicamente em ambientes com temperaturas entre 25 e 37ºC e formam colónias redondas e brancas após 48 - 72h de incubação em pratos de agar. Como foi referido, C. albicans é geralmente inofensiva. No entanto, certas alterações no corpo, como variações de pH, podem provocar o crescimento excessivo deste fungo, potenciando a sua patogenicidade e tornando-se a causa de uma série de condições médicas incluindo infecções vaginais ou orais. Estas infecções podem ter também fontes exógenas, como uso de catéteres ou transmissão entre pessoas. Quando a infecção por C. albicans, designada por Candidíase, atinge a corrente sanguínea facilmente se dissemina para outros orgãos internos. Este é o estágio de infecção mais grave pois o seu diagnóstico é difícil e, caso não seja feito em tempo útil, pode ter consequências graves. Este fungo pode atingir a corrente sanguínea quando o sistema imunitário do doente se encontra comprometido. O uso excessivo de antibióticos, o crescimento do números de tratamentos invasivos aplicados (como quimioterapia e o transplante de órgãos) que comprometem o sistema imunológico dos doentes, juntamente com o aumento de portadores de HIV faz com que o grupo de risco seja elevado e tem provocado um aumento do número de casos de Candidíase Invasiva. As espécies de Candida são a causa de 70-80% de infecções do sangue causadas por fungos, e 45-65% destes casos são causados por Candida albicans. Para além dos custos médicos que estes casos representam, 40% deles levam os pacientes à morte, sendo as infecções causadas por Candida albicans consideradas um problema de saúde pública. A principal razão para a elevada taxa de mortalidade referida deve-se ao facto deste tipo de infecções gerarem sintomas que são comuns a outros tipos de problemas, como febre ou outro tipo de sintomas dependendo do orgão atingido. Caso o organismo não responda ao tratamento utilizado, os órgãos do paciente podem parar de funcionar. Outra razão que contribui para dificultar o tratamento eficiente deste tipo de infecções são as próprias técnicas de diagnóstico presentes no mercado. O uso de técnicas de cultura é o mais utilizado para diagnóstico de infecções por fungos. No entanto, esta técnica demora entre 4 a 16 dias até confirmação do resultado definitivo e, para além disso, é muito pouco sensível, sendo 50% dos resultados falsos negativos. Outra técnica utilizada é ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), um teste imunoenzimático que permite a detecção de antigénios específicos (por exemplo, determinados anticorpos no plasma sanguíneo). Este teste é usado no diagnóstico de várias doenças e baseia-se na ligação do analito a ser detectado ao anticorpo específico desse analito e na posterior adição de um substracto que, caso essa ligação antigénio-anticorpo se verifique, muda de cor. Em adição, a densidade óptica deste produto dá informações sobre a concentração de antigénio presente. Esta técnica é altamente sensível mas bastante complexa e trabalhosa, demorando entre 2 a 3 dias para o resultado final. Concluindo, os métodos de detecção utilizados actualmente, são, em geral, complexos e demorados. Sendo por isso necessária a investigação de métodos mais rápidos, sensíveis e fáceis de utilizar. A área de biosensores está em grande desenvolvimento pelo seu potencial de redução da duração do processo de detecção e obtenção do resultado final, no entanto, ainda é necessário mais investigação para que eles sejam eficientes o suficiente para o seu uso na prática. Um biosensor é um sistema que converte uma resposta biológica a um analito específico num sinal mensurável. Os sistemas de transdução destes sinais podem ser, por exemplo, piezoeléctricos, ópticos ou electroquímicos. Os sensores electroquímicos são bastante utilizados na área de biosensores, inclusive com aplicações biomédicas com o objectivo de estudar as propriedades electroquímicas dos materiais e reações entre diferentes elementos biológicos. Um tipo de elementos biológicos associados aos sensores electroquímicos são anticorpos que funcionam como o elemento que permitem a identificação e detecção de diferentes tipos de antigénios, como fungos. Esta associação entre biossensores electroquímicos e anticorpos têm apresentado bons resultados em termos de sensibilidade e selectividade. Assim, tendo em conta a necessidade existente de um novo sistema de detecção de Candida albicans mais eficiente, este projecto consistiu no desenvolvimento de um biossensor electroquímico baseado na funcionalização de eléctrodos de ouro aplicados na superfície de uma membrana com anticorpos específicos C. albicans e cuja a reacção entre anticorpos e células provoca uma alteração da impedância da superfície dos eléctrodos permitindo assim a detecção da presença de Candida albicans na amostra analisada. A produção dos eléctrodos é feita sobre uma membrana pois a ideia do projecto final, que deverá continuar em desenvolvimento, é a produção de um sistema de filtragem que permita a separação dos vários elementos constituintes do sangue das células de C. albicans, de modo que o processo de tratamento da amostra e a sua detecção sejam feitos no mesmo dispositivo e em simultâneo. O projecto foi dividido em três grandes etapas. A primeira etapa consistiu na utilização da técnica ELISA, por ser um método já bastante desenvolvido e utilizado, para analisar os anticorpos utilizados e ter esta experiência como referência para os resultados futuros. No entanto, embora seja uma técnica comum, é bastante difícil de optimizar. Ainda assim, foi possível concluir que tipo de anticorpos a utilizar nas etapas seguintes é anti-candida policlonal e qual o limite de detecção desta técnica, 1680 CFU/ml (CFU significa unidade formadora de colónias e corresponde ao número de colónias contabilizadas na amostra em análise). A segunda etapa consistiu no estudo de qual a técnica de funcionalização mais eficiente a ser aplicada nas superfícies de ouro dos eléctrodos. Esta é uma das fases mais críticas no desenvolvimento de um sensor, pois é através da funcionalização adequada dos eléctrodos que é possível que a detecção ocorra. Assim, dependendo do processo de modificação da superfície, o sensor vai ser mais ou menos eficiente, quer a nível de selectividade, quer a nível de sensibilidade. Foram testados dois métodos diferentes, sendo que ambos utilizam a molécula LC-SPDP (succinimidyl 6-(3-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate) como cross-linker. No Protocolo 1, esta molécula foi previamente ancorada aos anticorpos e só depois eles foram aplicados à superfície. No Protocolo 2, o cross-linker foi primeiro aplicado à superfície dos eléctrodos e só depois os anticorpos foram utilizados para finalizar a modificação da superfície. Como método de avaliação da eficiência dos protocolos as células foram marcadas com um marcador de fluorescência, e após o tratamento das superfícies, incubação das células e lavagem para remoção das células que não foram capturadas pelos anticorpos, as superficies foram analisadas ao microscópio e o número de células à superfície foi contado. O Protocolo 1 verificou-se mais eficiente e, por isso foi o aplicado à última etapa do projecto. A última etapa do projecto consistiu no desenvolvimento do sistema electroquímico de detecção de Candida albicans em meio de cultura. Para tal, foi aplicado o Protocolo 1 de funcionalização e analisados vários espectros de impedância obtidos nas várias experiências que foram efectuadas de forma a caracterizar o sensor e optimizar o processo de detecção. Foram estudadas várias fases, desde optimização do processo de limpeza da superfície dos eléctrodos sem a degradar; testadas várias concentrações de anticorpos na funcionalização dos eléctrodos e, por fim, foram realizados testes para estudar a sensibilidade e selectividade do sensor na detecção de C. albicans. Dentro das várias experiências efectuadas foram obtidos resultados bastante promissores tendo sido possível atingir níveis de detecção de concentrações relevantes para a aplicação em ambiente clínico, 150 CFU/ml.Candida albicans (C. albicans) is a yeast that can be found in 80% of the population. It is a normal constituent of the human flora and is commonly found in the gastrointestinal tract and in the female genital tract. In people with low immunity, such as HIV (human immunodeficiency virus) patients and radiotherapy patients, this common yeast can cause serious problems. In fact, Candidemia is one of the most common fungal infections in human and it is difficult to eradicate due to the resistance of this yeast. The detection systems available nowadays involve techniques such yeast culturing and PCR (polymerase chain reaction) that are in general time consuming. In order to reduce the time of detection and also to identify early stages of the infection (low concentrations of yeast) we propose a new system of filtration of the blood sample integrated with electrochemical gold electrodes functionalized with specific antibodies to detect C. albicans. The novel sensor consists of the gold electrodes directly fabricated on a filter membrane. Electrochemical sensors are widely used in the biosensor field in order to study and detect reactions between different biological elements transforming these reactions into electrical signals. The first step of building a functional sensor is the development of the functionalization protocol. Here, we tested two different protocols of antibody immobilization. Protocol 1 consists of the attachment of a cross-linker on the tip of the antibody allowing for a better affinity to the surface and an oriented position of the antibody during the functionalization. Protocol 2 has the same purpose as Protocol 1, to allow a better affinity and orientation of the antibodies, but it is made with a different order. The attachment of a cross-linker is directly made on to the gold electrodes’ surface and, only after the preparation of the surface, the antibody is incubated to bind to the cross-liker. In order to compare both protocols, the C. albicans cells were marked with a fluorescent cell tracker and the number of cells in each sample was counted. The protocol with best results was Protocol 1. After the selection of the best functionalization protocol, the developed membrane-based sensor capable of detecting Candida albicans yeast in culture broth is presented in this work. The yeast cells were captured on electrodes specifically functionalized with anti-C.albicans antibodies during 15 minutes incubation and detection is achieved by electrochemical impedance spectroscopy. The sensor allows for quick detection of the yeast cells at clinically relevant concentrations (150 CFU/ml)