Diseño de una técnica biomolecular para la identificación de Haemophilus paragallinarum aislados de aves comerciales

En el presente estudio se diseñó una técnica molecular alternativa para la identificación de Haemophilus paragallinarum, agente causal de la Coriza Infecciosa, basada en el polimorfismo en longitud de los fragmentos de restricción de los genes ribosómicos 16S amplificados por la reacción en cadena de la polimerasa (RFLP-PCR). Esta metodología fue propuesta debido a que las técnicas, HPG-1 y HPG-2, las cuales vienen siendo utilizadas en la identificación de este patógeno, mostraron baja sensibilidad y reacción cruzada con Escherichia coli, respectivamente. En la técnica HPG-2 se encontró dos productos de amplificación entre 450 y 500 pb confundiéndose con el producto de 500 pb que se obtiene con H. paragallinarum. Para la estandarización de la técnica molecular propuesta, se utilizaron las cepas de referencia ATCC 29545, B y C de H. paragallinarum, y como controles negativos a Ornithobacterium rhinotracheale, Pasteurella spp., microorganismos con características morfológicas, bioquímicas y cuadros clínicos similares a H. paragallinarum; y E. coli, esta última, asociada en la Coriza Infecciosa complicada. Se utilizaron cebadores universales para amplificar los genes ribosómicos 16S con los que se obtuvo un fragmento de 1500 pb para todas las cepas, éstos fueron cortados con enzimas de restricción seleccionadas mediante el análisis de las secuencias de los genes ribosómicos 16S depositadas en el GenBank (banco de genes). Con el RFLP-PCR se obtuvo una mayor especificidad y sensibilidad ya que se identificaron perfiles genéticos específicos para H. paragallinarum y diferentes a los de O. rhinotracheale, Pasteurella spp y E. coli. La técnica diseñada fue utilizada en la identificación de 19 cepas aisladas de muestras clínicas de senos infraorbitarios y cornetes nasales de gallinas reproductoras, de postura y pollos de carne de diversas zonas del Perú obteniendo resultados reproducibles y demostrando la validez de esta técnica y su uso para una rápida identificación de microorganismos implicados en infecciones respiratorias en aves comerciales. Palabras claves: Haemophilus paragallinarum, Ornithobacterium rhinotracheale, Coriza Infecciosa, genes ribosómicos 16S, RFLP-PCR.--- In the present study, a technical molecular alternative for the identification of Haemophilus paragallinarum, causal agent of the Infectious Coryza, based on the restriction fragments length polymorphism of the 16S ribosomal genes amplified by the chain reaction polymerase (RFLP-PCR) was designed. This methodology was proposed due to the fact that the HPG-1 and HPG-2 techniques, which have been used for the identification of this pathogen, showed low sensitivity and crossed reaction with Escherichia coli respectively. In the HPG-2 technique, two amplification products between 450 and 500 bp were obtained, similar with the 500 bp product obtained with H. paragallinarum. For the standardization of the proposed molecular technique, we used the ATCC 29545 reference strain and the B and C strains of H. paragallinarum, as well as Ornithobacterium rhinotracheale, Pasteurella spp., microorganisms with similar morphological, biochemical characteristics and clinical signs to those of H. paragallinarum, and E. coli, bacterium associated in the complicated Infectious Coryza, as negative controls. Universal primers for amplifying the 16S ribosomal genes were used, obtaining a 1500 bp fragment for all strains which were cut by restriction enzymes selected by means of the analysis of sequences of the 16S ribosomal genes located in the Gene bank (bank of genes). With the RFLP-PCR a high specificity and sensibility were obtained since specific profiles for H. paragallinarum and different from those of O. rhinotracheale, Pasteurella spp. and E. coli were identified. The designed technique was used for the identification of 19 strains isolated from clinical samples of infraorbital sinus and nasal cornets of breeders and laying hens, and broiler chickens of diverse zones of Peru obtaining reproducible results and demonstrating the validity of this technique and its use for a rapid identification of microorganisms involved in respiratory infections in commercial birds. Key words: Haemophilus paragallinarum, Ornithobacterium rhinotracheale, Infectious Coryza, 16S ribosomal genes, RFLP-PCR.Tesi